离子液体在核酸和蛋白质分离中的萃取机理研究

pH对细胞色素C萃取率的影响实验表明，当溶液为中性时，细胞色素C不能直接被萃取到离子液体中，而当溶液为酸性时，部分细胞色素C能被萃取到离子液体中。其原因主要是由于在中性条件下，细胞色素C的疏水性氨基酸及血红素被包埋在细胞色素C的肽链中，pH降低后，肽链发生伸展使包埋在蛋白质肽链中的疏水性基团及血红素外露[16]，导致细胞色素C表面的疏水性基团增多，从而有利于萃取。

同时在萃取和反萃取实验中，细胞色素C的结构也发生改变。在pH为7时，细胞色素C的最大吸收波长为406nm，而在pH为1时，最大吸收波长从406nm转变为398nm，发生明显蓝移，这表明细胞色素C的结构发生改变。在反萃取溶液中细胞色素C的最大吸收波长为406nm，与标准细胞色素C相同，即在反萃取过程中其结构恢复到原始状态。

从以上分析可以看出，在萃取及反萃取过程中，细胞色素C的构型及结构改变是其萃取的主要原因，因此实验中采用CD光谱对细胞色素C的结构进行了测定。pH为7和1时细胞色素C的CD光谱，如图5-5所示。在pH为7时，标准细胞色素C在406nm处有一正峰，在420nm处有一明显的负峰，这主要是由于在细胞色素C的血红素分子中铁原子除了与卟啉的四个氮相配位外，其第五、六配位分别与邻近的组氨酸-18（His-18）和methionyl-80（Met-80）相配位[16]，而在pH为1时，细胞色素C水溶液在420nm处的负峰消失，而正峰明显蓝移到404nm，这主要是由于在pH为1时，血红素中的铁原子与Met-80配位键断裂，Fe3+不再与Met-80配位[17]。细胞色素C中的铁原子从六配位转变为五配位结构，与第四章中测得的血红蛋白的配位结构相同，其第六配位键可与离子液体的阳离子发生配位[18]，从而可实现细胞色素C的萃取。

图5-5　细胞色素C在不同pH条件下的CD光谱

细胞色素C浓度为200ng/μL(www.xing528.com)

基于上述实验结果，认为离子液体萃取细胞色素C的机理如图5-6所示。

图5-6　离子液体BtmsimPF6萃取细胞色素C的机理示意图

在中性水溶液中，疏水性基团及血红素被包埋在细胞色素C肽链中不利于萃取，同时细胞色素C铁原子的六个配位空间均被占据，离子液体的咪唑不能与铁原子配位。而细胞色素C在酸性条件下发生构型转变，肽链伸展使疏水性基团及血红素外露，从而增加了其在疏水性离子液体中的溶解性；同时，当溶液pH小于2时，细胞色素C铁原子与Met-80的配位键断裂，其第六个配位空间被解离，离子液体咪唑阳离子进入到肽链孔穴与铁原子发生配位，形成新的配合物而被萃取到离子液体中。