案例导入
案例：2017年底，根据群众举报，吉林省辽源市食品药品监督管理局联合公安机关成功破获“健康乐缘营养俱乐部”生产销售非法添加罗格列酮等药品的“鸿翔蜂胶茯苓山药片”食品案，查获以犯罪嫌疑人孙某、张某为首的生产销售非法添加药品的有毒有害食品团伙案，涉案金额达1000余万元。公安机关抓捕犯罪嫌疑人12人。鉴于当事人的行为涉嫌犯罪，该案件已移送公安机关处理。
讨论：1.罗格列酮是什么？误食含罗格列酮的保健食品可能引起什么危害？2.罗格列酮的快速检测方法有哪些？
血糖指血液中的葡萄糖，反映外源性和内源性葡萄糖经过血液的转运情况，为大脑等身体组织供应能量。血糖长期处于异常升高的水平，损害血管和多种器官的健康，是疾病风险因素。体重、饮食、运动等因素是血糖升高和多种疾病的主要风险因素，有效控制血糖，应对它们同时进行干预。降血糖类保健食品主要干预偏高的血糖，帮助其趋向于健康的水平变化。
我国糖尿病患者多，对糖尿病药品的需求量大。因此，我国的糖尿病OTC、保健食品市场也是种类繁多，其中不少产品鱼龙混杂，尤其是一些标榜纯中药却非法掺加西药成分的情况最为常见。最常见的非法添加有罗格列酮、格列苯脲等医治糖尿病的西药。
罗格列酮（Rosiglitazone）属噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂，其作用机制与特异性过氧化物酶体增殖因子激活剂的γ型受体（PPARγ）有关。通过增加骨骼肌、肝脏、脂肪组织对胰岛素的敏感性，提高细胞对葡萄糖的利用而发挥降低血糖的疗效，可明显降低空腹血糖及胰岛素和C肽水平，对餐后血糖和胰岛素也有降低作用。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理，罗格列酮在3类致癌物清单中。罗格列酮可造成血浆容积增加和由前负荷增加引起的心脏肥大，诱发心力衰竭。合并使用其他降糖药物时，有发生低血糖的风险。老年患者可能有轻中度水肿及轻度贫血。
一、胶体金免疫层析法
1.范围
本方法规定了声称具有辅助降血糖功能保健食品中罗格列酮的胶体金免疫层析快速筛查方法。
本方法适用于声称具有辅助降血糖功能的保健食品中罗格列酮成分的快速筛查。
固体样品1.0μg/g，液体样品1.0 μg/mL。
2.原理
本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的罗格列酮经提取后与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条或检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线（T线）与质控线（C线）颜色深浅比较，对样品中罗格列酮成分进行定性判定。
3.试剂及材料
①除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682-2016规定的二级水。
④浓盐酸。
⑤吐温-20。
⑥盐酸溶液A：量取浓盐酸16.7 mL，用水溶解并稀释至100 mL。
⑦缓冲液B：称取12.1 g Tris碱，加适量水溶解，混勻，用盐酸溶液A调节PH至8.0，加入5.0 g吐温-20搅拌均勻，定容至1000 mL。
⑧参考物质。
参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、分子量见表10-2，纯度均≥99%。
表10-2 参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、分子量
⑨罗格列酮标准储备液（1.0 mg/mL）：精密称取适量罗格列酮参考物质，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇勻，配制成浓度为1.0 mg/mL的标准储备液。-20℃避光保存，有效期1年。
⑩罗格列酮标准工作液（10 μg/mL）：精密移取适量罗格列酮标准储备液（1.0 mg/mL）分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇勻，配制成浓度为10 μg/mL的标准工作液。-20℃避光保存，有效期3个月。
⑪材料。
罗格列酮胶体金免疫层析试剂盒及配套的试剂（可选），适用基质为保健食品。
4.仪器设备与实验条件
（1）仪器设备
天平：感量为0.1 mg和0.01 g，涡旋混合器，移液器：200 μL、1000 μL、5 mL，离心机：转速可达4000 r/min以上，读数仪：产品配套可使用的检测仪器（可选）。
（2）实验条件
环境条件：温度10～40℃，相对湿≤80%。
5.分析步骤
（1）试样制备
液体样品充分混勻，半固体、浆体、悬浮液体、固体样品充分均质或粉碎混勻。
（2）试样提取和净化
①液体基质。
量取（0.5±0.02）mL试样于15 mL离心管中，加入4 mL缓冲液B，涡旋混合3s，作为待测液。
②半固体、浆体、悬浮液体、固体基质。
准确称取制备好的试样（0.5±0.01）g于15 mL离心管中，加1 mL甲醇，涡旋30s，4000 r/min离心2 min或静置2 min。取250 μL上清液于2 mL离心管中，加入750 μL缓冲液B，涡旋混合30s，作为待测液。
注：试样提取和净化过程可按照试剂盒说明书操作，不做限定。
（3）测定步骤
①试纸条与金标微孔测定步骤。
吸取200 μL样品待测液于金标微孔中，抽吸5～10次使混合均勻，室温温育5 min；温育结束后，将试纸条吸水海绵端垂直向下插入金标微孔中，室温温育5 min，从微孔中取出试纸条，去掉试纸条下端的吸水海绵，进行结果判定。
注：测定步骤建议按照试剂盒说明书。
②检测卡与金标微孔测定步骤。
吸取200 μL上述待测液于金标微孔中，上下抽吸5～10次使混合均勻。室温温育5 min，将反应液全部加入到检测卡的加样孔中，将金标微孔中全部溶液滴加到检测卡上的加样孔中，温育5 min，进行结果判定。
注：测定步骤建议按照试剂盒说明书。
（4）质控试验
每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。
①空白试验。
准确称取固体空白试样（0.5±0.01）g或量取液体空白试样（0.5±0.02）mL于15 mL离心管中，与试样同法操作。
②加标质控试验。
准确称取固体空白试样（0.5±0.01）g或量取液体空白试样（0.5±0.02）mL于15 mL离心管中，加入适量标准工作液，使罗格列酮参考物质浓度为1.0μg/g或1.0 μg/mL，与试样同法操作。
6.结果判定
通过对比质控线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。目视判定示意图见图10-5。结果判定也可根据产品说明书进行。
（1）无效
质控线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条无效。
（2）阴性结果
质控线（C线）显色，检测线（T线）颜色比质控线（C线）颜色深或检测线（T线）颜色与质控线（C线）颜色相当，均表示样品中不含待测组分或含量低于方法检测限，判为阴性。
（3）阳性结果
质控线（C线）显色，检测线（T线）颜色比质控线（C线）颜色明显浅或检测线（T线）不显色，均表示样品中待测组分含量高于方法检测限，判为阳性。
（4）质控试验要求
空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。
图10-5 目视判定本意图
7.结论
罗格列酮在食品中属于非法添加物，故在保健品中不得检出。
当检测结果为阳性时，应对结果进行确证，确证不得采用快检方法。
8.其他
本方法分析步骤和结果判定可以根据厂家试剂盒的说明书进行，但应符合或优于本方法规定的性能指标。
本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。但方法使用者应使用经过验证的满足本方法规定的各项性能指标的试剂、试剂盒。
本方法参比标准为：BJS 201710《保健食品中75种非法添加化学药物的检测》、2009029《降糖类中成药中非法添加化学药品补充检测方法》、KJ 201902《保健食品中罗格列酮和格列苯脲的快速检测胶体金免疫层析法》。
本方法使用罗格列酮试剂盒可能与吡格列酮存在交叉反应，当结果判定为阳性应对结果进行确证。
1.范围
本方法规定了利用激光拉曼光谱法快速检测声称具有辅助降血糖功能保健食品中微痕量罗格列酮的定性检测方法。
本方法适用于声称具有辅助降血糖功能保健食品中罗格列酮的快速检测。
本方法检出限为0.1 mg/kg。
2.原理
试样经二步萃取提取后直接测定。样品中的罗格列酮分子与表面增强试剂混合后，分子吸附在表面增强纳米颗粒上，其拉曼散射信号得到增强，使用便携式激光拉曼光谱仪通过自动判别其特征峰即可定性检测出罗格列酮。
3.试剂及材料
表面增强试剂A：金纳米溶胶，表面增强试剂B：1%氯化钠水溶液，乙酸乙酯：分析纯，硫酸溶液：0.3 mol/L，离心管：1.5 mL、15 mL。
4.仪器及设备
便携式激光拉曼光谱仪，离心机：转速不低于3900 r/min，天平：感量为0.1 g，粉碎机，研钵。
5.分析步骤
（1）试样制备
液体样品充分混勻，半固体、浆体、悬浮液体、固体样品充分均质或粉碎混勻。
（2）试样提取和净化
称取捣碎样品0.1 g（液体1 mL）于10 mL离心管中，向离心管中加入3 mL乙酸乙酯，涡旋萃取3 min后，离心分层，上层有机相为提取液。吸取0.5 mL提取液于2 mL离心管中，加入0.5 mL硫酸溶液，涡旋3 min，离心分层，下层溶液为待测液。
（3）仪器参数
激光功率：200 mW；扫描时间：5 sec；扫描次数：2；平滑参数：4。
（4）测定步骤(www.xing528.com)
依次向检测瓶中加入500 μL纳米金增强试剂A、100 μL待测液、100 μL 1%的氯化钠溶液，混匀上机检测。
6.结果判定
根据谱图1171 cm-1（±5 cm-1）、1322 cm-1（±5 cm-1）处特征拉曼光谱，对保健食品中的罗格列酮进行评估：如同时存在上述特征峰，则可判定样品中含有罗格列酮；否则，不能证明样品中含有罗格列酮，需要进一步实验验证。食品中罗格列酮表面增强拉曼光谱图参见图10-6。
图10-6 罗格列酮表面增强拉曼光谱图
7.结论
罗格列酮在食品中属于非法添加物，故在保健品中不得检出。
当检测结果为阳性时，应对结果进行确证，确证不得采用快检方法。
8.其他
①本方法仅用于保健食品中罗格列酮的快速检测。
③拉曼光谱仪一阶光谱峰中心位置重复性为±5 cm-1。
目标检测
一、单项选择题
1.胶体金免疫层析法测保健食品中西地那非的测定步骤中，使用检测卡与金标微孔进行测定时，样品待测液的吸取体积是（）。
A.100 μL
B.200 μL
C.300 μL
D.400 μL
2.胶体金免疫层析法测保健食品中西地那非试验中，所需的实验环境条件是（）。
A.温度10～40℃，相对湿度≤80%
B.温度10～20℃，相对湿度≤80%
C.温度10～40℃，相对湿度≤50%
D.温度25～40℃，相对湿度≤70%
3.下列化合物中经常添加在降压类保健食品中是（）。
A.硝苯地平
B.西地拉非
C.西布曲明
D.罗格列酮
4.拉曼光谱仪一阶光谱峰中心位置重复性为（）。
A.±5 cm-1
B.±10 cm-1
C.±1 cm-1
D.±20 cm-1
5.激光拉曼光谱法快速检测保健食品中西布曲明试验中，在提取和净化时第一步萃取西布曲明的试剂是（）。
A.乙腈
B.乙酸乙酯
C.乙醇
D.甲醇
6.激光拉曼光谱法快速检测保健食品中西布曲明时，下列哪个是西布曲明的特征峰（）。
A.1200 cm-1（±5 cm-1）
B.1088 cm-1（±5 cm-1）
C.950 cm-1（±5 cm-1）
D.1250 cm-1（±5 cm-1）
7.胶体金免疫层析法测保健食品中罗格列酮的试验中，固体样品第一步使用的提取试剂是（）。
A.乙醇
B.甲醇
C.乙酸酯
D.异戊醇
二、填空题
1.胶体金免疫层析法测保健食品中西地那非时，每批样品应同时进行空白试验与______________试验。
2.激光拉曼光谱法快速检测保健食品中西布曲明试验中，当样品中的西布曲明与表面增强试剂混合后，分子吸附在表面增强纳米颗粒上，其拉曼散射信号_____。
3.激光拉曼光谱法快速检测保健食品中西布曲明试验中，第二步萃取用的试剂是__________，浓度为_______。
4.降血糖类保健食品中罗格列酮的快速检测方法有_______和________。
三、判断题
1.用激光拉曼光谱法快速检测保健食品中硝苯地平，当检测结果为阳性时，需要对实验结果进行确证。（）
2.进行样品前处理时，液体样品不需要进行试样制备，可以直接取样。（）
3.盐酸西布曲明适用于饮食控制、运动不能减轻和控制体重的肥胖症治疗，那它可以添加到具有减肥功能保健食品中。（）
4.罗格列酮在食品中属于非法添加物，在保健品中不得检出。（）
5.采用竞争抑制免疫层析原理的快检方法对保健食品中的罗格列酮等化合物进行检测时，质控线（C线）显色，检测线（T线）颜色比质控线（C线）颜色深，判为阳性。（）
四、多项选择题
A.西地那非
B.西布曲明
C.他达那非
D.格列苯脲
2.快速检测保健食品中西地那非时，哪几个特征峰同时出现时可以判定样品中含西地那非（）。
A.1234 cm-1（±5 cm-1）
B.1525 cm-1（±5 cm-1）
C.1581 cm-1（±5 cm-1）
D.1260 cm-1（±5 cm-1）
3.激光拉曼光谱法快速检测保健食品中硝苯地平时使用的表面增强试剂是（）。
A.1%氯化钠水溶液
B.2%氯化钠水溶液
C.3%氯化钠水溶液
D.金纳米溶胶
4.采用竞争抑制免疫层析原理的快检方法对保健食品进行检测时，下列哪几种条件都具备时检测结果才有效（）。
A.质控线（C线）显色
B.质控线（C线）不显色
C.空白试验测定结果应为阴性
D.加标质控试验测定结果应为阳性
答案及解析
一、单项选择题
1.B 2.A 3.A 4.A 5.B 6.B 7.B
二、填空题
1.加标质控
2.增强
3.硫酸溶液、0.3 mol/L
4.胶体金免疫层析法、激光拉曼光谱法
三、判断题
1.√2.×3.×4.√5.×
四、多项选择题
1.AC 2.ABC 3.A D 4.ACD
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