环境微生物采样与保存方法

7.1.1.1　环境水样

环境水样主要包括天然水体（如江、河、湖、海）、饮用水和污水。用于微生物分析的环境水样，需采用高压灭菌的清洁容器收集。根据环境水样类型以及目标微生物的不同，环境水样的采集有不同的要求。当饮用水样品微生物含量较低，常需要采集大体积的水样（1～1 000L）进行微生物富集。另外，由于饮用水中含有一定剂量的消毒剂，水样采集后需加入硫代硫酸钠（Na2S2O3）中和消毒剂，防止水中残留的消毒剂在水样运输过程中对细菌灭活，确保所采集的水样能够保持刚被采集时的状态。天然水体和污水样品微生物含量较多，采样50～100mL即可满足后续分析的要求。

用于微生物分析的环境水样在从采样现场到实验室运输途中，通常需要4℃低温保存，以减少微生物在运输过程中再生长或者死亡。同时，缩短样品从采集到实验室分析的时间也可以很大程度上提高分析结果的准确性。绝大多数微生物分析标准要求样品在采集后24～72h进行分析。

对于低浓度微生物水样，可通过微孔过滤或离心分离等手段进行微生物富集。过滤法适合低浊度水样。常用于过滤微生物的滤膜孔径为0.22μm 或者0.45μm，截留于膜表面的微生物可直接倒扣至培养基培养，或再次悬浮于小体积（1～5mL）液体中，用于后续培养或者分子生物学分析。值得注意的是，0.22μm 或者0.45μm 的滤膜理论上可用于液体除菌，但是一部分微生物量仍可通过滤膜，还可能黏附于过滤容器上，造成一定量的微生物损失。因此，建议在实验之前通过加标回收的方式评价不同滤膜对不同微生物的回收率。离心分离法可用于低浊度和高浊度样品的微生物富集。将水样以3 000r离心30min或者6 000r离心10min，离心后去除上清液，底部沉淀物可以再次悬浮于2～20mL无菌水溶液中用于后续培养或者分子生物学分析。

7.1.1.2　土壤样品

土壤能提供微生物生长繁殖的各种营养物质和有利条件，被视为微生物的“天然培养基”，是微生物最为活跃的场所。基于不同的研究目的，可对不同类型、不同深度的土壤样品进行采集。土壤表层土采集深度通常为5～20cm，去除枯枝落叶和碎石颗粒等杂质并过筛后，装入无菌自封袋中，实验室-80℃冷冻保存，用于后续微生物分析。(www.xing528.com)

可用于传统平板培养的微生物不到土壤微生物总量的10%，甚至更低，绝大多数微生物处于不可培养状态，需要用基于土壤微生物DNA 提取的分子生物学技术进行土壤微生物鉴别和多样性分析。环境土壤样品成分复杂，其中腐殖酸等成分将影响所提取土壤DNA的纯度并严重抑制聚合酶链式扩增（Polymerase Chain Reaction，PCR）中Taq（thermus aquaticus）DNA 聚合酶以及限制性内切酶活性，对后续实验影响很大。如何去除腐殖酸等杂质，并获得完整、高纯度DNA 是土壤DNA 提取的关键。

土壤DNA 提取一般分为直接法和间接法两类。直接提取法是直接裂解土壤微生物，再提取DNA。该方法的优点是直接从土壤样品中获得DNA，更能体现土壤微生物多样性，缺点是DNA 纯度较低且提取过程中腐殖酸同时溶出，影响后续实验分析。间接法是通过离心等方式先将微生物与土壤分离，再提取DNA。该方法的优点是提取的DNA 纯度较高，但回收率低，不能提取所有细菌的DNA。目前市场上有许多基于上述原理的商品化土壤DNA 提取试剂盒，如Power Soil DNA Isolation Kit，Fast DNA Spin Kit for Soil等可供选用。试剂盒法方便快捷，所提取DNA 的纯度和完整度较高，成本亦较高。具体采用何种方法提取DNA，依据研究目的和土壤性质而定。提取后的DNA 常用琼脂糖电泳检验完整性，用光密度比值OD260／OD280和OD260／OD230（Optical Density，OD）来判定DNA 的纯度。一般要求OD260／OD280在1.6～1.8之间，OD260／OD230大于2。

7.1.1.3　空气样品

大气中的微生物包括细菌，真菌，放线菌等多种。估计每立方米空气中存在的细菌数超过106个。大气微生物可附着在气溶胶颗粒物上，随空气流动传播对人体健康产生潜在不利影响。影响室外空气微生物群落组成的因素主要有大气温度、湿度、风速和光照等，而室内空气微生物群落变化则与室外空气源、通风时间和房间占用情况等因素有关。

大气微生物的采集方法主要有自然沉降法和气流撞击法。自然沉降法就是空气微生物通过重力作用沉降到培养基上培养，该方法无法对空气体积进行定量，并且重力沉降受气流等环境因素的影响，实验误差较大。气流撞击法利用动力抽气，每分钟抽取恒定的气流量，将微生物收集到0.22μm 的无菌滤膜上，该膜可以直接在培养基上培养，也可以直接用于DNA 抽提。该方法能收集到附着在悬浮颗粒物上的细菌，且不受气流影响，采样量准确。目前市面上采用的Anderson等大气分级采样器，采用串联冲击分级原理可以分级采集超细粒子、细粒子和较大颗粒物，适用于室内和室外样品的采集。膜滤法采集微生物气溶胶可分为以下几个主要步骤：①将石英纤维滤膜置于铝箔纸中，在500℃～550℃烘箱中烘烤5～12h，将灭菌干燥后的滤膜冷却后放入无菌自封袋；②在采样点架置空气采样器，用75%乙醇清洗采样头内外，将滤膜用消毒后的镊子小心放入采样器，避免污染；③打开采样器并持续运行24h；④样品收集完毕后，将滤膜小心取出，样品收集面朝内折叠，置于灭菌铝箔上，称重、保存；⑤将滤膜转移入无菌离心管，加入磷酸盐缓冲溶液，4℃低速离心3h；⑥去除滤膜、上清液，将底部颗粒物转移，用于后续分析。采样器抽气流速可根据分析需求进行调整，每张滤膜收集的空气体积为5～1 000m3。