生防领域：拮抗细菌的应用

目前，国内外已筛选出多种拮抗细菌，但大多为直接使用菌株或菌剂防治病害。因此，它们的货架期（销售保质期）及效果稳定性就难以得到保证。况且，活菌虽可被直接用于防治土传病害，在土壤内或种子上常具有杀菌、刺激等多种功能，但对植物茎、叶、果病害的防治则表现得不太理想。只有通过提取和纯化其抗菌物质（包括抗生素与抗菌蛋白），才能将微生物发酵品变成真正的、标准的生物农药，从而更好地用于农业生产。另外，还可以构建转基因工程菌并培育转基因抗病植物。近年来，国内外开始研究拮抗微生物的遗传背景，克隆和分离了一些产生抗菌物质的基因。因此，通过遗传工程技术，构建高效、多抗转基因工程菌，或将微生物的抗菌基因转入植物，以培育转基因抗病品种，将是植物真菌病害及其他植物病害生物防治研究的重点。

目前，对植物病害的防治主要采用化学农药杀灭病原菌，但化学农药对人畜的毒副作用和残留问题至今仍难以得到有效的解决。从微生物工程的角度出发，利用微生物产生的抗病原真菌的活性物质进行植物病原真菌病害的生物防治具有周期短、易于研究、便于生产、无毒、无害等优点，从而为研制新型的、无毒的、无公害的生物农药提供了依据^[48]。自20世纪80年代末开始，国内利用有益拮抗微生物的研究日趋活跃，形成了生物源农药研制应用的新的热点。其中，中国农业大学（原北京农业大学）开发的“益微（增产菌）”“特立克”“克瘟灵”“消蚀灵”“棉康宁”，南京农业大学研制的“菜丰宁”，以及西南农业大学⁽¹⁾推广的“丰收菌”，在全国累计应用面积超过十几亿亩⁽²⁾，拓宽了植物病害生物防治技术途径^[49]。国内外至今已有多种Bacillus属细菌被成功地开发成产品并得到推广，如：美国Alabama州的Bacillus subtilis GB03既能有效防治植物病害，又能促进植物生长，已得到大面积推广使用。其商品名为Kodiak^[50]。陈志谊等研制的Bacillus subtilis B-916菌液防治水稻纹枯病的效果达50％～81％，与井冈霉素按一定比例混合后可提高防病效果，已在江苏等地推广2000hm2以上^[51]。目前，已形成规模生产的部分生防菌剂如表1-1^[52]所示。

表1-1　已形成规模生产的部分生防菌剂

表1-2　目前已登记注册的微生物农药（拮抗细菌制成）^[53]

至今为止，大多数抑制植物病原菌和腐生真菌离体生长的蛋白质都是从植物材料中鉴别出来的，但在微生物中也普遍存在^[54]。如果将编码此种抗菌蛋白的基因转入植物体内，使该植物也能合成微生物起源的抗真菌蛋白，则该植物也同样能显示出抗真菌性。因此，寻找某些抑制病原真菌生长繁殖的抗菌蛋白基因，将其纯化并导入植物体内，是目前农作物抗真菌病害基因工程研究的一大热点^[55]。

研究应用于生物防治的遗传工程微生物（Genetically Engineered Microorganisms）就是利用基因操作技术对某种微生物进行遗传改造，引入外来的具有防病、杀虫等作用的基因；或切除原有的、具有不良作用的部分基因；或插入一段DNA，以改变原来基因的调控与表达，从而促使微生物生防作用的加强或防治范围扩大，为高效微生物农药的研制开辟了新的途径。如：世界上第一个商品化的遗传工程杀菌剂为防治根癌病的工程菌Nogall。20世纪70年代，Kerr等发现了放射土壤杆菌（A．raidobacter）K84菌株通过分泌细菌素agrocin84对引起桃树根癌病的根癌土壤杆菌（A．tumerfaciens）有显著的抑制作用。近年来，又通过遗传构建了更为安全有效的工程菌株K1026。该菌已通过田间药效及安全性试验，定名为Nogall，并作为第一个商品化的遗传工程杀菌剂在澳、美、日等国开始登记销售。

在我国，“荧光93”是防治小麦全蚀病的工程菌。彭于发等于1987年将转座子Tn5导入小麦根部定植的荧光假单胞菌基因组内，从5100个转移接合子中选出了对全蚀病菌离体的拮抗作用提高2～3倍，并有明显刺激生长作用的菌株D93，它连续5年在冬春麦田间试验中一直保持稳定的防效，平均增产二成以上。该工程菌已被定名为“荧光93”。

对防治真菌病害有效的几丁质酶基因的利用的研究也取得了可喜进展。几丁质（Chitin）是除卵菌（Oomycetes）外大多数病原真菌细胞壁的主要成分。过去曾发现土壤中富含几丁质的甲壳类物质诱导分泌几丁质酶（Chitinase）的微生物增殖，而减轻镰刀菌（Fusarium）、丝核菌（Rhizoctonia）引起的植物病害。近年，国外对土壤细菌（Serratia marcescens）几丁质酶基因的结构与功能做了许多研究。Sandherm等于1988年将此基因导入荧光假单胞菌工程菌株，可抑制立枯菌菌丝，并使萝卜根腐病的危害明显减轻。Chet等于1991年报道，将此基因转入哈茨木霉（Trichoderma harzianum），可使后者对土壤病原真菌的防治效果进一步提高^[55]-^[56]。另外，任春梅等（2002）用细菌几丁质酶基因转化番茄和烟草，采用农杆菌介导法将细菌几丁质酶基因分别转化番茄和烟草子叶，获得了抗卡那霉素的转化植株^[57]-^[58]。(www.xing528.com)

对高效价抗性荧光假单胞菌的研究也正在进行中。以对水稻纹枯病菌具有抗生作用的荧光假单胞杆菌为受体，应用转基因方法，筛选出了4株远远高于母株抗生作用的荧光假单胞杆菌菌株，比对照母株提高抗性128％～187％。

（1）生防效果不稳定

在引入新生防菌时，要打破原来固有的生态平衡是较困难的。这可能是生防效果不稳定的重要因素之一。生防菌的定殖是较复杂而困难的问题。据Leben报道，喷施荧光假单胞菌拮抗菌后1d，在苹果树叶上存活的拮抗菌减少了99％。Knudsen研究了对花生叶斑病菌的拮抗细菌在田间的存活情况，认为在2周后，细菌的数量从103～104/叶减少到10～102/叶；而Mew设想植物表面最初引进的拮抗菌要维持一个有效计量，因此推测在植物的表面存在一个“支持系统”。Willocquet认为，从水稻的纹枯病病斑中流出的分泌物是拮抗菌生长的最合适的来源。根据此“支持”系统的假设，只有在水稻植株处于纹枯病发生初期才喷施拮抗菌，这样使拮抗菌更易存活和定殖。基于此理论，寻求一种更有效的支持系统，或筛选、利用植株固有拮抗内生菌，使植物终生受生防菌株的作用，而不受或少受外界环境的影响，使病害造成的损失降到最低。生防效果不稳定的问题仍然是摆在科研工作者面前的重要课题。

（2）有益微生物的局限性

有益微生物一般生活在一定的环境中（包括土壤类型、温度、pH等）。所以，生产上拮抗菌对环境的适应性较窄，且有的菌株对农药的反应较敏感，并表现出较窄的抗病谱。这一问题可用基因工程、诱变等方法将有益微生物改造成高抗逆性、广适应性、高产性、高控害能力性、多抗性的超级工程菌株。这也是发展生防菌利用技术的工作重点。

（3）拮抗和促生的结合较难

拮抗作用是衡量生防效果的指标之一。试验证明，在许多植株的根际或叶面存在对植株有促生作用的微生物，如荧光假单胞菌。孟颂东（1998）提出，这可能与微生物能产生一定量的生长素有关。如何使拮抗菌和促生菌有机结合仍是拮抗菌利用的难题之一。陆凡等，以及杨大旗等分别分离到了既有拮抗作用又有促生作用的拮抗菌株，证实了这些拮抗菌对植株的生长和发育起了重要的作用，且真正达到了防病增产的效果。所以，如何在生产中选育、分离这类菌也是生防工作者的目标之一。