转基因食品的检测方法详解

近几年，随着转基因食品的快速发展，转基因食品的安全性受到广泛关注，虽然迄今为止尚未发现有证据表明转基因食品对健康和环境存在危害，但由于转基因食品的安全性评价具有累积性和潜在性特点，并与社会、文化及伦理等多方面因素互为影响，所以需要多方位长期系统的监测才能对其安全性做出较为客观的评价，其中转基因食品的检测技术尤为重要。转基因食品的安全性检验，第一步是对受检产品进行鉴定，以区别转基因食品与非转基因食品，筛选出在遗传分化过程中已失去转基因特性的产品；第二步是对受检产品中导入的基因重组体构成的变异情况进行检测，以确定其表达的忠实性及外源基因对受体生物原基因组表达的影响。当前，国际社会对转基因食品检测采用的技术路线主要有两条：针对外源DNA和针对外源蛋白质进行检测。检测要求已从定性检测提高到定量检测。

目前人们日常生活中的转基因食品主要是转基因植物食品。转基因植物所采用的外源启动子主要为来源于菜花叶病毒的CaMV35S启动子和根瘤农杆菌的nos启动子以及玄参花叶病毒的FMV35S启动子；广泛应用的外源终止子有来源于根瘤农杆菌的nos终止子和菜花叶病毒的CaMV终止子以及新霉素磷酸转移酶NPtII终止子。针对这些基因的检测可涵盖绝大部分转基因植物。

（一）核酸的提取

对食品中转基因成分的核酸检测先要进行核酸的提取。由于食品成分复杂，除含有多种原料组分外，还含有盐、糖、油、色素等食品添加剂。另外，食品加工过程会使原料中的DNA会受到不同程度的破坏，因此食品中转基因成分的核酸提取尤其是DNA的提取具有其特殊性，并且其提取效果受转基因食品的种类和加工工艺等影响。选择适宜的核酸提取方法是进行转基因食品核酸检测的首要条件。

（二）定性筛选PCR技术

聚合酶链式反应（Polymease Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA、RNA的地方。

PCR定性检测是高灵敏度的DNA水平检测，但常伴有各种假性结果出现：①DNA提取时产生的各种反应抑制因子，使PCR呈假阴性；②产品深加工时核酸被破坏成碎片，含量极低，使PCR呈假阴性；③当作物受到菜花叶病毒的感染而带有35S启动子或因农杆菌感染而带有nos终止子时，PCR呈假阳性；④实验室的残留污染使检测结果呈假阳性；⑤在收获、运输或加工过程中转基因食品与非转基因食品产生交叉污染也会使检测结果不准确。

（三）实时荧光定量PCR法

实时荧光PCR技术最早在1996年由美国Applied Biosystems公司推出，是指在常规PCR基础上添加了一条标记了两个荧光基团的探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法。

目前应用于实时定量PCR检测体系中的荧光探针主要有三种：分子信标探针、TaqMan探针和杂交双探针。实时定量PCR检测的灵敏度至少是竞争PCR的10倍，它可以检测到每克样品中含2pg转基因的DNA量。对加工、未加工和混合样品都可以进行检测。

（四）基因芯片检测法

基因芯片检测技术是20世纪90年代由美国的Affymetrix公司首先发展起来的，该公司曾在1996年制造出世界上第一块商品化基因芯片。迄今为止，应用于转基因食品检测的前沿技术当属基因芯片技术，其实质就是高度集成化的反向斑点杂交技术。探针分子固定在载体上，待测基因经过PCR、末端标记等操作，成为标记有荧光染料或同位素的核酸分子，然后与固定的探针杂交。依据标记方法的不同，通过放射自显影、激光共聚焦显微镜或CCD相机读出每个斑点信号的强度，计算机对杂交信号进行处理，得到杂交谱。

（五）多重连接依赖的探针扩增（MLPA）

作为转基因多重定量检测的最新进展，此法最初是由荷兰的Schouten于2002年发表的应用于医学检测目的高度灵敏的相对定量技术。其利用简单的杂交、连接、PCR扩增反应，于单一反应管内同时检测最多40个不同的核苷酸序列的拷贝数变化。MLPA方法是针对不同检测序列设计多组专一的探针组，对探针组进行扩增的检测方法。每组探针组总长度不同，可与目标序列杂交黏合。所有探针的5′端都有通用引物结合区PBS（Primer Binding Sites），5′端都有与待扩增目标序列结合区，在PBS区与目标序列结合区之间插入不同长度的寡核苷酸，由此形成长度不一样的探针组。如果目标序列缺失、产生突变或是由于不同探针组的配对，则这组探针无法成功连接，也没有相应的扩增反应。如果这组探针可与目标序列完全黏合，则连接酶会将这组探针连接成为一个片段，并通过标记的通用引物对连接在一起的探针组进行扩增，最终经过毛细管电泳和激光诱导的荧光来检测扩增产物。(www.xing528.com)

转基因食品中导入的外源DNA片段会表达产生特异蛋白，因此可针对该特殊蛋白制备相应抗体，依据抗原与其抗体能特异性结合的免疫学特性，就能通过抗原抗体反应来判断样品中是否含有外源蛋白。

（一）酶联免疫吸附实验（ELISA）

酶联免疫吸附是一种酶联免疫技术。用于检测包被于固相板孔中的待测抗原（或抗体）。即用酶标记抗体，并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。其基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

ELISA分析法特异性高、操作简单、成本低、稳定性好，但如果食品中被测蛋白浓度较低时会出现假阴性。此外，食品加工过程也会使蛋白变性导致假阴性。该法只适用于原料性食品，难应用于加工品，因为外源基因表达的蛋白会因加工而失活、分解或消失，增加了检测的不确定性和较差的重复性，同时也提高了假阴性率。目前，FDA已研究出用双夹心ELISA法检测食品中是否含有转基因玉米成分。

（二）蛋白质印迹法（Western Blotting）

蛋白质印迹法是一种分析和鉴定特定蛋白质的技术，将经过凝胶电泳分离的蛋白质转移到膜（如硝酸纤维素膜、尼龙膜等）上，再对转移膜上的蛋白质进行检测的技术。检测常用与特定蛋白结合的标记抗体或配体。由此可判断特定蛋白质的存在与否和分子质量大小等。该方法将电泳较高的分离能力、抗体的特异性和放射性自显影的灵敏性结合起来，对分析不溶性蛋白有较好的效果。

小结

随着全球经济一体化的发展，各国间贸易往来日益增加，科技信息交流频繁，食品安全已经跨越了国界。某一地区的食品安全问题很有可能波及全球。因而完善转基因食品的安全监管体系，加强我国转基因食品的立法和管理工作，提高食品安全检测技术水平迫在眉睫。转基因食品的多种检测方法各有其优缺点，在实际检测中，应该根据食品种类和加工类型的不同选择适当的检测方法。各国有关转基因成分标签法的建立和不断完善，对食品中转基因成分的检测方法提出了更高的要求，同时随着转基因食品种类的日益多样化和高产量化，转基因食品的检测技术将朝着高通量、高灵敏度、自动化和低成本化的方向发展。应该进一步寻找快速、简便和精确的实验方法，加强国际合作与交流，确定通用检测标准，让具有安全保障的转基因食品摆上国人餐桌。

思考题

1. 什么是转基因食品？它有什么特点？

2. 简述转基因食品的安全性问题，结合实际生活谈谈你对转基因食品的看法。

3. 检测转基因食品的方法有哪些？其优缺点各是什么？