食品中维生素A和维生素E的检测方法优化

维生素A和维生素E是机体维持正常代谢和机能所必需的脂溶性维生素。维生素A具有促进机体生长、维持表皮完整等功能；维生素E又称为生育酚，其中以α-生育酚的生物效应为最高，具有促进生育、抗衰老的作用。维生素A和维生素E的检测方法主要有高效液相色谱法、比色法等，其中高效液相色谱法是《食品中维生素A和维生素E的测定》（GB/T 5009.82—2003）中的第一法。

1.原理

试样中的维生素A及维生素E经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中，用高效液相色谱法C₁₈反相柱将维生素A和维生素E分离，用紫外检测器检测，并用内标法定量测定。

2.试剂与仪器

（1）试剂

1）常用试剂：无水硫酸钠、甲醇（重蒸后使用）、重蒸水（水中加少量高锰酸钾，临用前蒸馏）、抗坏血酸溶液（100g/L，临用前配制）、（1+1）氢氧化钾溶液、氢氧化钠溶液（100g/L）、硝酸银溶液（50g/L）、pH试纸。

2）无水乙醚（不含有过氧化物）。

①过氧化物的检查方法：用5mL乙醚加1mL质量分数为10%的碘化钾溶液，振摇1min，若有过氧化物，则放出游离碘，水层呈黄色或加4滴质量分数为0.5%的淀粉液，水层呈蓝色。该乙醚需处理后使用。

②去除过氧化物的方法：重蒸乙醚时，瓶中放入纯铁丝或铁末少许，弃去10%初馏液和10%残馏液。

3）无水乙醇（不得含有醛类物质）。

①检查方法：取2mL银氨溶液置于试管中，加入少量乙醇，摇匀，再加入100g/L氢氧化钠溶液，加热，放置冷却后，若有银镜反应，则表示乙醇中有醛。

②脱醛方法：取2g硝酸银溶于少量水中，取4g氢氧化钠溶于温乙醇中，将两者倾入1L乙醇中，振摇后，放置于暗处两天（不时摇动，促进反应），然后过滤，置于蒸馏瓶中蒸馏，弃去初蒸出的50mL。当乙醇中含醛较多时，应适当增加硝酸银用量。

4）银氨溶液：加氨水至硝酸银溶液（50g/L）中，直至生成的沉淀重新溶解为止，再加1100g/L氢氧化钠溶液数滴，若发生沉淀，则再加氨水直至沉淀溶解。

5）维生素A标准液：视黄醇（纯度为85%）或视黄醇乙酸酯（纯度为90%）经皂化处理后使用。用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其含视黄醇的量大约为1mg/mL。临用前用紫外分光光度法标定其准确含量。

6）维生素E标准液：α-生育酚（纯度为95%）、γ-生育酚（纯度为95%）、δ-生育酚（纯度为95%）。用脱醛乙醇分别溶解以上三种维生素E标准品，使其质量浓度大约为1mg/mL。临用前用紫外分光光度法分别标定此三种维生素E的准确含量。

7）内标溶液：称取苯并[e]芘（纯度为98%），用脱醛乙醇配制成10μg/mL的苯并[e]芘内标溶液。

（2）仪器 实验室常用设备、高压液相色谱仪（带紫外分光检测器）、旋转蒸发器、高速离心机、小离心管（带塑料盖和1.5～3.0mL的塑料离心管，与高速离心机配套）、高纯氮气、恒温水浴锅、紫外分光光度计。

3.分析步骤

（1）试样的处理

1）皂化：称取1～10g样品（含维生素A约3μg，含维生素E各异构体约40μg）置于皂化瓶中，加30mL无水乙醇，进行搅拌，直到颗粒物分散均匀为止，然后加5mL 10%抗坏血酸和2.00mL苯并（e）芘标准液，混匀，再加10mL（1+1）氢氧化钾，混匀，于沸水浴上回流30min，使其皂化完全，皂化后立即放入冰水中冷却。

2）提取：将皂化后的试样移入分液漏斗中，用50mL水分2次或3次洗皂化瓶，将洗液并入分液漏斗中，用约100mL乙醚分两次洗皂化瓶及其残渣，将乙醚液并入分液漏斗中。若有残渣，则可将此液通过有少许脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗中。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。

3）洗涤：用约50mL水洗分液漏斗中的乙醚层，用pH试纸检验，直至水层不显碱性（最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加）。

4）浓缩：将乙醚提取液经过无水硫酸钠（约5g）滤入与旋转蒸发器配套的250～300mL球形蒸发瓶内，用约100mL乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠3次，将洗液并入蒸发瓶内，并将其接至旋转蒸发器上，于55℃水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中剩下约2mL乙醚时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹掉乙醚，然后立即加入2.00mL乙醇，充分混合，溶解提取物。

5）将乙醇液移入一小塑料离心管中，以5000r/min的转速离心5min，取上清液供色谱分析用。如果样品中维生素含量过少，则可用氮气将乙醇液吹干后，再用乙醇重新定容，并记下体积比。

（2）标准曲线的绘制

1）维生素A和维生素E标准质量浓度的标定方法：取维生素A和各维生素E标准液若干微升，分别稀释至3.00mL乙醇中，并分别按给定波长测定各维生素的吸光度，用比吸光系数计算出该维生素的质量浓度。测定条件见表7-7-5。

表7-7-5 测定条件

维生素A和维生素E质量浓度的计算公式为(www.xing528.com)

式中 c₁——维生素A和维生素E的质量浓度（g/mL）；

A——维生素平均紫外吸收度；

E——某种维生素1%比吸光系数；

V——加入标准液的量（μL）；

——标准液的稀释倍数。

2）绘制标准曲线：本方法采用内标法定量。把一定量的维生素A、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚及内标苯并[e]芘液混合均匀。选择合适的灵敏度，使上述物质的各峰高约为满量程的70%，为高浓度点，高浓度的1/2为低浓度点（其内标苯并[e]芘的浓度值不变），用此浓度的混合标准进行色谱分析。维生素标准曲线是以维生素峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标，维生素浓度为横坐标绘制的，或计算直线回归方程。若有微处理机装置，则按仪器说明用二点内标法进行定量。

本标准不能将β-E和γ-E分开，故γ-E峰包含有β-E峰。

（3）高效液相色谱分析 高效液相色谱参考条件如下：

1）预柱：ultrasphere ODS 10μm，4mm×4.5cm。

2）分析柱：ultrasphere ODS 5μm，4.6mm×25cm。

3）流动相：（98+2）甲醇-水溶液，混匀，临用前脱气。

4）紫外检测器波长为300nm，量程为0.02。

5）进样量：20μL。

6）流速：1.7mL/min。

（4）试样分析 取试样浓缩液20μL，待绘制出色谱图及色谱参数后，再进行定性和定量。

1）定性：用标准物色谱峰的保留时间定性。

2）定量：根据色谱图求出某种维生素峰面积与内标物峰面积的比值，以此值在标准曲线上查到其含量，或用回归方程求出其含量。

4.结果计算

式中 X——维生素的含量（mg/100g）；

c——由标准曲线上查到某种维生素的含量（μg/mL）；

V——试样浓缩定容体积（mL）；

m——试样质量（g）。

结果保留三位有效数字。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

5.试验说明

1）由于这两种维生素在外界环境中不稳定，易受光、氧等影响而被氧化破坏，因此试验操作应在微弱光线下进行，或用棕色玻璃仪器，避免维生素的破坏。

2）乙醚为溶剂的萃取体系，易发生乳化现象。在提取、洗涤过程中，不要用力过猛，若发生乳化现象，则可加几滴乙醇。