固定化微生物细胞的制备方法优化

固定化微生物细胞和固定化酶的方法都是以酶的应用为目的，其制备方法也基本相同。传统分类主要有吸附法、包埋法、共价结合法、交联法四大类，另外还有热处理法、无载体法等。其中用于固定化增殖细胞的方法主要有吸附法和包埋法两大类。

（一）吸附法

吸附法是利用载体对细胞的亲和性或通过静电吸引将细胞直接吸附在水不溶性载体上的一种固定化方法，又叫载体结合法。微生物细胞与载体之间不起化学反应，具有操作简单、固定化条件温和、细胞活性损失小、载体可以反复使用等优点，所以被广泛应用和深入研究。缺点是吸附容量小、吸附力较弱、易脱落。特别在底物分子较大、介质离子强度和pH变化的情况下，操作稳定性差，使用受到了一定限制。吸附法分为物理吸附和离子结合两种，如图10-2所示。

物理吸附法是通过氢键、疏水键等作用力将细胞或酶吸附于不溶性载体的方法。很多类型的微生物细胞，具有吸附在固体表面的天然倾向，能比较牢固地“粘”在载体上，从而形成固定化细胞。

图10-2 物理吸附法示意图

物理吸附法中，常见的细胞吸附载体及用途如表10-1所示。在环境保护领域内使用的活性污泥中含有各种各样的微生物，这些微生物可以沉积吸附在硅藻土、多孔玻璃、多孔陶瓷、多孔塑料等载体的表面，用于各种有机废水的处理，降低废水中的化学需氧量（COD）和生化需氧量（BOD）；各种霉菌会长出菌丝体，这些菌丝体可以吸附缠绕在多孔塑料、海绵、聚氨酯泡沫及金属丝网等载体上用于生产有机酸和酶等。

表10-1 常见的细胞吸附载体及用途

离子吸附是利用微生物在解离状态下因静电引力作用而固定于带有相反电荷的离子交换剂上。与物理吸附相比，离子吸附比较牢固一点，吸附效果较好。常用载体有离子交换树脂、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素等。

（二）包埋法

将细胞定位于凝胶网格内或聚合物半透膜胶囊中的技术称为包埋法，分为凝胶包埋法和微胶囊法，如图10-3所示。

1. 凝胶包埋法

将酶或微生物菌体包埋在高分子凝胶网格中的包埋方法，称为凝胶包埋法，这种方法包埋的颗粒属于网格型。微生物固定化方法中，凝胶包埋法是固定化微生物中用得最多、最有效的方法。其原理是将微生物细胞截留在水不溶性的凝胶孔隙的网络空间中。

凝胶包埋法具有方法简单、条件温和、稳定性好，细胞增殖快等的优点。其主要缺点：①载体存在扩散限制作用，且扩散阻力还会导致固定化酶动力学行为的改变，降低酶活力；②许多载体形成凝胶后对高分子底物的通透性差，只有小分子可以通过高分子凝胶的网格扩散。因此，凝胶包埋法只适合作用于小分子底物和产物的酶，对于那些作用于大分子底物和产物的酶是不适合的。

图10-3 包埋法示意图

常用的凝胶包埋剂有琼脂、海藻酸钠、卡拉胶、明胶、聚丙烯酰胺（ACAM）、聚乙烯醇（PVA）等。根据包埋剂的特性，凝胶包埋法分为海藻酸钙凝胶包埋法、卡拉胶包埋法、聚丙烯酰胺凝胶包埋法等，各种包埋法所采用的凝胶又具有各自的优缺点。

（1）海藻酸钙凝胶包埋法 海藻酸钙凝胶固定化细胞一般用“钙盐法”生产。其原理通常是利用海藻酸钠溶于水，而其钙盐不溶于水，易形成耐热性凝胶的特性，在其钠盐溶液中加入氯化钙作为凝胶成型剂，使Ca²⁺与海藻酸根螯合形成不溶于水的海藻酸钙凝胶网络，从而将微生物细胞包埋固定，具体如图10-4和图10-5所示。

图10-4 海藻酸钙网络形成模型

图10-5 滴落法制备固定化细胞

以海藻酸盐为载体，建立包埋固定化微生物的方法：先将海藻酸钠溶于水，加热杀菌冷却，然后将海藻酸钠溶液与一定体积的细胞或孢子悬浮液混合均匀，使海藻酸钠最终浓度为2%～3%，再将海藻酸钠与菌体混合液用注射器或滴管滴入5%的氯化钙溶液中，固定化7～8h，形成球状固定化细胞胶粒，最后滤出颗粒，用生理盐水洗净，备用。

海藻酸钠和氯化钙在实验室中易获得，成本相对其他固定化方法来说较低。但在高浓度电介质（K⁺，Na⁺）溶液中，固定化颗粒不稳定，Ca²⁺易脱落，从而使凝胶的机械强度下降。

（2）琼脂凝胶包埋法 琼脂是一种天然高分子多糖，琼脂凝胶截留细胞是一种非常简单易行的微生物细胞固定化方法。琼脂凝胶形成模型如图10-6所示，其原理是在溶液中改变一个或多个参数（如温度、盐浓度、pH或溶剂），一些天然或合成高分子聚合物，通过沉淀作用形成凝胶。

图10-6 琼脂凝胶网络形成模型

利用琼脂在温度高于50℃时熔化，而低于此温度时则凝固的特性，将其溶于水后与微生物混合，然后冷却凝固或加入非水相溶液中，从而制成固定化微生物。其特点是包埋微生物活性较高，制作较容易。缺点是氧和底物及产物的扩散受到限制，琼脂凝胶的机械强度较差，且成球受温度影响较大。

做一做 以琼脂为载体，建立包埋固定化微生物细胞的方法

将琼脂加热溶于水，冷却至45～50℃，使琼脂溶液与微生物细胞混合均匀，琼脂的最终浓度为3%。

方法一：将琼脂与微生物细胞的混合液倒入已灭菌的培养皿中，使之冷却凝固，然后将凝胶切成3mm×3mm×3mm的小方块，用生理盐水洗净，备用。

方法二：在45～50℃条件下，将琼脂与微生物细胞混合物用针形管滴入上层是液体石蜡、下层是水的量筒中，然后滤出固定化细胞颗粒，用生理盐水洗净，备用。

（3）卡拉胶包埋法 卡拉胶是一种海藻多糖，广泛用作食品添加剂。20世纪70年代末，人们开始用卡拉胶作为固定化微生物细胞的载体。卡拉胶有三种类型：κ-卡拉胶、λ-卡拉胶和ι-卡拉胶，其中，κ-卡拉胶是一种较好的固定化载体。

与琼脂一样，卡拉胶可以通过冷却形成双螺旋结构来形成凝胶。对于电荷较高的κ-卡拉胶只有当阳离子，如K⁺或Ca²⁺存在时，双螺旋之间才会发生凝聚，从而形成凝胶化，如图10-7所示。阳离子填充到凝聚体中，抑制双螺旋链之间的静电排斥。利用该法制备固定化细胞的方法简单，反应条件温和，得到的固定化细胞的活性高。

K⁺离子存在下生成凝胶的具体方法：一定量的胶悬浮于水中，加热溶解灭菌冷却至35～50℃，然后加入一定量细胞悬浮液混匀，趁热滴到预冷的氯化钾溶液中，或冷的植物油中，成型后再滴氯化钾溶液，形成小球状固定化细胞胶粒或片状等。可用NH₄⁺、Ca²⁺替代K⁺。当卡拉胶浓度低时，强度不够，可加戊二醛等交联剂再交联处理，进行双重固定化。

图10-7 阳离子引起的凝胶化

（4）ACAM凝胶包埋法 ACAM凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂作用下聚合形成三维网状结构的凝胶。常用的催化剂和加速剂是过硫酸铵和四甲乙二胺（TEMED）或三乙醇胺。(www.xing528.com)

一般操作：先配制一定浓度的丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺溶液，然后与一定浓度的细胞悬浮液混合，再加入一定量的过硫酸铵和四甲基乙二胺，混合后让其静置聚合，从而获得所需形状的固定化细胞胶粒。这种方法制备的凝胶颗粒机械强度高，适用于多种细胞的固定化。

（5）PVA包埋法 PVA是一种新型的微生物包埋固定化载体，PVA-H₃BO₃包埋法采用硼酸（H₃BO₃）作为交联剂，利用PVA在加热后溶于水，然后与微生物细胞混合均匀，滴入饱和H₃ BO₃溶液中，通过醇与酸的酯化反应，制成不溶于水的固定化细胞颗粒。利用该法制得的凝胶颗粒机械强度高，使用寿命长且弹性好。

（6）光交联树脂包埋法 采用一定相对分子质量的光交联树脂预聚物（Mr：1000～3000），加入1%左右光敏剂，加水成一定浓度，加热至50℃，然后与一定浓度的细胞悬浮液混合，摊成一定厚度薄层，在紫外光照3min，交联固定化制成固定化细胞，无菌下切成一定形状。

该法的优点：树脂孔径随预聚物分子量不同而改变（孔径可调整）；强度大，可连续使用较长时间；易固定，紫外线照射几分钟即可完成；对细胞生长繁殖和新陈代谢没有影响。

2. 微胶囊法

利用半透性聚合物薄膜将细胞包埋起来的方法，称为微胶囊法，这种类型属于微囊型。这类方法和凝胶包埋法一样只适用于小分子底物，对大分子底物不适用。

图10-8 微胶囊包埋细胞

微胶囊法一般通过乳化作用，利用半通透性聚合物薄膜将细胞包埋起来，形成微型胶囊（图10-8）。具体又可分为界面聚合法、液体干燥法、分相法和液膜法等几种。微囊直径一般为1～100μm，有的直径达到700μm或更大一些。膜厚约100nm，膜孔径约3.6nm，表面积与体积之比极大，有利于底物和产物的扩散。

（三）共价结合法

共价结合法是利用细胞表面的反应基团（如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基等）与活化的无机或有机载体反应，形成共价键将细胞固定，如图10-9所示。用该法制备的固定化细胞一般为死细胞。该法操作稳定性高，但由于试剂的毒性，易引起细胞的破坏。

图10-9 共价结合固定细胞

（四）交联法

化学交联法使用双功能和多功能试剂，如醛和胺，使微生物细胞或酶之间进行反应，从而将细胞或酶彼此交联，形成网状结构，即成固定化细胞，如图10-10所示。交联剂有很多，主要有戊二醛、聚乙烯亚胺等。

图10-10 交联固定细胞

与共价结合法一样也是利用共价键固定微生物细胞或酶，不同的是它不使用载体，最常用的交联剂是戊二醛。该法可得到高细胞浓度，结合强度高，稳定性能好，经得起pH和温度的剧烈变化。由于交联试剂的毒性，对细胞活性影响很大，往往会毒害活细胞。所以交联法的应用受到一定限制，实际中常与包埋法等联合使用。

概念解析 共固定化技术

共固定化是将酶、细胞器和细胞同时固定于同一载体中，形成共固定化系统，这种系统比较稳定，可将几种不同功能的酶、细胞器和微生物细胞进行协同作用。共固定化技术是在混合发酵技术和固定化技术的基础上发展起来的一门新技术，可以充分利用酶和细胞各自的催化功能，将一些原来不能由细胞直接利用的底物变成可以直接利用的底物（由于酶的存在将底物及时进行了转化，保证了反应的进行），大大提高了生产效率。

共固定化的形式：①细胞/细胞，如啤酒酵母与大肠杆菌； ②细胞/酶，如黑曲霉与过氧化氢酶； ③细胞器/酶，如叶绿体与氢化酶。

共固定化交联法一般是将脱水干燥的微生物细胞（如啤酒酵母）悬浮在要结合的酶溶液中（如纤维素酶、蛋白酶等），使酶沉积在细胞壁上，脱水后加入戊二醛和单宁使酶和细胞交联在一起，形成共固定化生物催化剂，如图10-11所示。用这种方法制备的固定化生物催化剂主要由外表包有酶的单一微生物细胞构成。根据应用目的不同，既可固定活细胞，也可固定死细胞。

图10-11 用酶包埋细胞共固定化

海藻酸盐共固定是先用交联剂（如1%的碳化二亚胺）把酶和2%海藻酸钠共价结合，然后加入细胞（如酵母），混匀后，再把含酶和细胞的海藻酸钠混合物滴加到2%～4%的CaCl₂溶液中，形成包埋型共固定化颗粒，如图10-12所示。这种方法适用范围很广。

图10-12 海藻酸盐共固定化微生物细胞和酶

（五）热处理法

热处理法是将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而得到固定化菌体。例如，将培养好的含葡萄糖异构酶的链霉菌细胞在60～65℃的温度下处理15min，葡萄糖异构酶将全部固定在菌体内。热处理法只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化，热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。热处理法也可与交联法或其他固定化法联合使用，进行双重固定化。

（六）絮凝法

絮凝法是利用某些微生物细胞具有自絮凝形成颗粒的能力而对细胞进行固定化的方法，又称无载体法，或自固定化法。微生物细胞的自絮凝通常指细胞在生长期间发生的无性凝集。絮凝作用首先在酵母培养过程中观察到的，后被证实其现象是由于悬浮在液体中的单细胞聚集成絮凝物或丝状物，然后出现沉淀或漂浮的结果，如图10-13所示。在液体发酵后期，菌种良好的絮凝性不仅可使发酵液澄清速度加快，提高细胞分离的性能，而且还可防止细胞自溶，因此，细胞絮凝性是评价菌种优劣的一个重要指标。

图10-13 絮凝颗粒示意图

利用微生物细胞自絮凝形成颗粒作为一种固定化技术，是一个全新的概念。与各种载体固定化细胞技术相比，具有非常突出的优点，主要体现在：①细胞的固定化方法非常简单，一般在摇瓶培养阶段就可以快速形成絮凝颗粒，培养液澄清透明，絮凝细胞颗粒可以在生物反应器中逐级扩大培养，不产生细胞固定化过程的附加成本；②不使用细胞生长和代谢产物合成所需营养物质以外的其他任何化学物质，细胞的生理和生态环境不受外来物质的干扰和影响，有利于目标代谢产物的顺利合成；③自絮凝细胞颗粒内部结构呈松散型，传质阻力很小，而且其颗粒内部表面不断自我更新，颗粒整体活性非常好；④在生物反应器中一定的生理、生态、物理、化学和流体力学条件下，小颗粒的絮凝和大颗粒的解离可以呈动态平衡，不存在载体固定化细胞的强度问题。

此外，自絮凝固定化细胞在颗粒的形成过程中可以营造出一个适宜的微生态环境，使之有利于微生物代谢过程中彼此之间的协调，或者说有利于微生物之间生物信息的传递。

微生物絮凝是一个极复杂的现象，不仅受环境、生理等方面影响，而且与遗传因子、蛋白质有关。与化学絮凝剂相比，絮凝剂本身是微生物菌体，不会产生二次污染，无毒、无害，使用安全。目前发现絮凝效果最好的絮凝剂是红平红球菌对废水处理具有明显的效果。虽然微生物絮凝剂在发酵工业、医药工业和废水处理中有广阔的应用前景，但目前微生物絮凝剂的研究还主要停留在实验室研究阶段。