氧化石墨烯在植物抗病领域的应用探析

植物被病原体侵染后会出现腐烂、畸形及萎蔫等病害症状，植物的产量及品质受到严重威胁，病原体对农业生产造成巨大危害。GO被证明具有较高的杀菌活性，作为杀菌剂，对病原体的生长与繁殖有一定的抑制作用。例如，水稻白叶枯菌是一种常见的植物病原菌，会引发水稻的细菌感染。GO在极低剂量（250μg/mL）的条件下仍然表现出了对水稻白叶枯菌的强杀菌性能，细菌死亡率约为94.48％，而常见杀菌剂噻枯唑对应的细胞死亡率仅为13.3％（Chen，2013）。GO通过沉积在孢子表面、抑制水分吸收及诱导质壁分离而有效减少禾谷镰孢菌和梨孢镰孢菌的分枝和生物量，抑制孢子萌发（Wang，2014）。rGO（100mg/L和200mg/L）显著抑制了灰霉菌（B. cinerea）的生长。利用rGO对玫瑰花瓣进行处理，灰霉菌在花瓣上的繁殖半径得到了有效控制，减少了病斑的数量，降低了花瓣的腐烂程度（Hao，2017）。在温室条件下，利用100ppm的Ag/DNA/GO复合物对番茄进行处理，细菌性叶斑病的发病率显著降低（Ocsoy，2013）。GO还具有杀虫功效，贴附在昆虫玉米螟体壁上，造成物理损伤。GO与农药相结合可以增加农药的杀虫效果（Wang，2019）。

Hongwei Zhu小组将GO作为一种新型的杀菌剂应用于切花保鲜。切花是一种脱离母体的观赏性植物，其切口处的微生物污染引起的茎堵塞是缩短切花瓶插寿命的重要原因之一。微生物会在茎底端切口处繁殖并产生代谢产物，形成一层生物膜，最终堵住输水导管。切口处细菌造成的堵塞会严重阻碍切花对水分的进一步吸收，破坏切花自身的水分平衡，导致花瓣膨压下降，花朵迅速萎蔫、凋亡。因此，抑制细菌堵塞是提升切花观赏价值、增加切花寿命的有效途径。

利用不同浓度的GO水溶液（0mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L）（GO0、GO0.1、GO1、GO10、GO100、GO500、GO1000、GO2000）培养切花月季。从切花月季放置于试管中开始（第0天）直至切花几乎全部萎蔫为止（第6天），每天拍照记录切花月季的外部形态，结果如图6-6所示。观察发现，与未加GO的GO0组相比，低浓度的GO0.1组和GO1组中的切花月季盛开更早，盛花期时间有所延长，且花瓣颜色更为鲜艳，更具观赏价值。GO10组与对照组差别不大。而高浓度的GO100组、GO500组、GO1000组、GO2000组中的切花尚未完全盛开即开始衰败过程，花瓣边缘发黑且部分凋落，花朵出现严重歪头现象，观赏价值大幅降低。

图6-6

不同浓度（0mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L）GO水培切花月季的照片（0～6d）

切花的瓶插寿命定义为从切花插入瓶中开始至失去观赏价值（凋落、花瓣变色、花朵歪头）这一时间段。对每组条件下10枝切花月季的瓶插寿命进行统计分析，如图6-7（a）所示。结果表明，GO0组中切花的瓶插寿命为4.0d。相比之下，低浓度的GO延长了切花瓶插寿命。其中，GO0.1组中切花的平均瓶插寿命最长，为5.3d，之后依次为GO1组（4.7d）和GO10组（4.2d）。而高浓度的GO对切花月季表现出了较高的毒性作用。与GO0组样品相比，GO100组、GO500组、GO1000组、GO2000组的切花瓶插寿命缩短了1～2d，且大多数切花第2天就出现歪头萎蔫等衰败现象。

图6-7

（a）不同浓度（0mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L）GO水培切花月季的瓶插寿命（结果为平均值±标准差，样品数n=10）；（b）低浓度（0mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L）GO水培切花月季的花茎比值变化（结果为平均值±标准差，样品数n=10）（0～4d）

花径值是衡量切花观赏价值的主要指标之一，花径值越大，切花的观赏性越强。花径值的变化趋势从侧面反映了切花的生命进程：花径值增大时对应切花的初开期和半开期；花径值维持不变时对应切花的盛开期；花径值减小时对应切花的萎蔫期。对衰败萎蔫的切花统计花径值无意义，而高浓度组的切花衰败过早，所以本实验仅对GO0组、GO0.1组、GO1组、GO10组的切花花径进行为期4d的统计分析，如图6-7（b）所示。结果表明，低浓度GO（GO0.1、GO1、GO10）组的花径比值（切花每天的花径值除以初始花径值）均高于GO0组的花径比值，提升了切花的品质和观赏价值。GO0.1组的花径比值在前4d不断增加，说明切花在持续开放。GO1组和GO0组的花径比值从第4天开始下降，切花开放3天。GO10组的花径比值从第3天开始下降，切花仅开放2天。

ROS是植物细胞处于氧化应激态时有氧代谢的副产物，由细胞内线粒体产生，主要包含H2O2、羟基自由基等。正常情况下，ROS可通过多种细胞酶或非酶机制快速去除。然而，在某些外界环境（如水分胁迫、温度胁迫、光照胁迫、物理损伤、有毒气体等）的胁迫刺激下，会产生大量的ROS。过量的ROS积累会降低细胞内酶活性，干扰细胞正常代谢机制，并对细胞成分和结构造成严重损伤。研究表明，纳米材料与植物接触，会诱发细胞产生氧化应激反应，进而对细胞产生毒性作用。因此，本实验利用二氨基联苯胺（DAB）染色法检测GO0组、GO0.1组、GO1组、GO10组、GO100组、GO500组、GO1000组、GO2000组中切花花瓣的ROS含量。

切花水培3d后，摘取切花最外层的花瓣进行DAB染色实验，结果如图6-8所示。棕黄色沉淀位置代表H2O2在花瓣中的积累位点，即ROS的积累位点。与GO0组的花瓣相比，GO100组、GO500组、GO1000组和GO2000组的切花花瓣均含有较大面积的棕黄色沉积，且沉淀颜色较深，说明ROS在细胞中的积累量较高。GO10组与GO0组的ROS积累水平相当，在花瓣的中间和边缘处出现了少量的棕黄色沉淀。GO0.1组和GO1组的花瓣整体颜色偏浅，除了边缘处的少许黄色沉淀外，其他位置未发现明显的黄色积累位点。而花瓣边缘的几处呈点状分布的深黄色沉淀很可能对应一些机械损伤所导致的ROS积累。综上分析，与GO0组相比，低浓度的GO0.1组和GO1组在一定程度上缓解了外界胁迫，这两组中的切花受外界胁迫干扰小，除机械损伤造成的ROS积累外，并无明显的ROS积累位点，细胞氧化应激水平低。而高浓度的GO100组、GO500组、GO1000组和GO2000组中切花受外界胁迫程度加剧，细胞氧化应激水平较高，表现出明显的毒性作用。

图6-8

不同浓度（0mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L）GO水培切花花瓣细胞内活性氧自由基水平（标尺：1cm）

以上实验结果表明不同浓度的GO会诱发细胞产生不同程度的氧化应激反应。细胞内过高的ROS积累会导致细胞死亡。为探究GO对切花花瓣细胞的毒性作用，采用台盼蓝染色法评估各组中切花花瓣细胞的死亡率。水培3d后，摘取切花最外层的花瓣进行台盼蓝染色实验，结果如图6-9所示。蓝色位点代表细胞膜被破坏，细胞死亡。从图中可以看出，不同浓度的GO对细胞造成的死亡程度与ROS积累程度具有很好的对应关系。GO100组、GO500组、GO1000组和GO2000组的切花花瓣上的蓝色沉淀较为明显，GO1000组的花瓣几乎全部被染成蓝色，GO500组中花瓣中间位置出现深蓝色沉淀，说明高浓度的GO对花瓣细胞膜造成了严重损伤。对GO10组和GO0组花瓣的蓝色面积进行比较，发现GO10组中花瓣细胞的死亡率略高于GO0组，两组花瓣的中间位置仍存留具有活性的细胞。与GO0组相比，GO0.1组和GO1组的花瓣仅在边缘处有少量浅蓝色沉淀，花瓣整体呈粉白色，这说明低浓度GO处理的切花花瓣的细胞膜结构完整、活性高。

图6-9

不同浓度（0mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L）GO水培切花花瓣细胞的死亡率（标尺：1cm）

细胞膜相对透性是衡量细胞死亡率的主要指标之一，通过对溶液中电解质的测试可以间接检测细胞膜的相对透性。细胞膜相对透性越高，说明细胞膜受损越严重，细胞死亡率越高。切花水培0d、2d、4d、6d时，摘取切花最外层的花瓣进行检测，结果如图6-10所示。水培前4d，GO0.1组中切花花瓣细胞膜相对透性几乎不变，始终维持在约10％，切花无任何衰败迹象，与之前花径测试实验结果相符。水培第6天，花瓣细胞膜的相对透性增至18.5％。GO0组、GO1组和GO10组中花瓣细胞膜的相对透性在水培前4d增加缓慢，这三组中花瓣细胞膜的相对透性非常接近。而高浓度的GO100组、GO500组、GO1000组和GO2000组中花瓣细胞膜的相对透性在水培第2天即明显增加，这说明此时花瓣细胞结构已经变得不完整，细胞开始死亡，切花开始衰老。水培第4天，GO500组和GO2000组中花瓣细胞膜的相对透性分别达到18.5％和17.4％。水培第6天，GO1000组和GO2000组中花瓣细胞膜的相对透性分别达到31.6％和29.6％。与GO0组相比，高浓度的GO（GO100、GO500、GO1000、GO2000）显著加速了花瓣细胞的死亡，提高了细胞死亡率；而低浓度的GO（GO0.1、GO1）则减缓了花瓣细胞的死亡，降低了细胞死亡率。

图6-10

不同浓度（0mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L）GO水培切花花瓣细胞膜的相对透性变化（结果为平均值±标准差，样品数n=3）（0～6d）

前面从外部形态和生理指标（ROS水平、细胞死亡率）两方面揭示了GO对切花的影响。高浓度的GO对切花表现出高毒性，而低浓度的GO则表现出有益的作用。为明确GO对切花的影响机制，需要进一步从GO/切花茎切口界面入手，对其进行表征分析。分别用直接观察、体视显微镜表征和SEM表征对GO/切花茎切口界面进行分析，结果如下。

（1）直接观察

每天对不同条件下的切花茎切口处进行观察，并拍照记录，结果如图6-11所示。仅经过1d的水培，高浓度GO100组、GO500组、GO1000组和GO2000组中切花茎切口处便积累了大量的GO，其中GO1000组和GO2000组的切口横切面完全被GO覆盖，而GO100组和GO500组的切口横切面处GO呈外环形覆盖。之后，GO1000组和GO2000组的切花茎切口处不再有明显变化，而GO100组和GO500组的切口横切面处GO由外至内以环形方式逐渐覆盖，且最初外环形位置的覆盖颜色逐渐加深，这说明GO积累量增加。观察低浓度GO0.1组、GO1组和GO10组中切花茎切口处发现，GO0.1组水培6d后仍无肉眼可见的GO积累，外观与GO0组无差别。GO1组和GO10组中GO仅在切口外环处有一定积累，GO1组在水培约4d时，可观察到GO积累但积累量较低，GO10组在水培约2d时，可观察到GO积累。

对图6-11进行纵向对比，GO在切口处的积累量随着时间的增加而逐渐增加。对图6-11进行横向对比，GO在切口处的积累量随着培养液中GO浓度的增加而逐渐增加。观察结果表明，GO在切口处的积累有一定顺序，均是由外至内，以环形逐渐递进对切口进行覆盖。高浓度GO100组、GO500组、GO1000组和GO2000组中切口的外环处被GO大量覆盖的时间为水培后1d，这四组中大部分切花在水培后第1～2天出现萎蔫歪头等现象，这说明切花所表现出的性状与GO在切口处的积累密切相关。

图6-11

不同浓度（0mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L）GO水培切花茎切口处照片（0～6d）

（2）体视显微镜表征

利用体视显微镜对茎切口处GO的积累进行更为清晰的观察。图6-12为第6天不同浓度（0mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L）GO水培切花茎切口处的体视显微镜表征照片。观察发现高浓度GO100组、GO500组、GO1000组和GO2000组中切口处全部被GO覆盖，GO在纵向上积累一定的厚度，整体结构蓬松无序。使用体视显微镜进一步观察发现GO10组中花茎的木质部及周围的髓射线全部被GO覆盖，髓结构处积累了极少量的GO，木质部重复分布于茎边缘的外环位置。观察GO0.1组和GO1组的切花茎切口处，GO在近似半圆形的木质部处有所积累，但在其他位置无积累。另外，GO0.1组中GO在花茎木质部处的积累呈点状分布。GO0组为纯水培养，所以无GO积累，但在木质部处也观察到几处污染位点。

图6-12

第6天不同浓度（0mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L）GO水培切花茎切口处的体视显微镜表征照片（第1、3行中标尺为1mm；第2、4行中标尺为400μm）

图6-13为第6天不同浓度（0mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L）GO水培切花距茎底端1cm处横切面的体视显微镜照片。GO0.1组和GO1组的茎横切面很干净，未观察到杂质，与GO0组的茎横切面相似，而GO10组、GO100组、GO500组、GO1000组和GO2000组中茎横切面的木质部中均观察到少量的GO，GO呈点状分布，与图6-12中GO0.1组中观察到的GO积累方式和位点一致。

图6-13

第6天不同浓度（0mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L）GO水培切花距茎底端1cm处横切面的体视显微镜照片（第1、3行中标尺为1mm；第2、4行中标尺为400μm）

切花需要通过不断地从培养液中吸收水分来维持细胞的正常代谢功能并保持自身的外部形态。木质部的主要动能为向上运输水分子及溶解于水中的无机盐等物质，兼具支撑作用。其主要组成部分有导管、管胞、木纤维等，其中导管是水分和无机盐的传输通道，在木质部中呈无规则点状分布。结合图6-12和图6-13的结果分析可知，GO溶解于水中，很可能通过导管通道随着水分子一同进入植物体内，所以图6-13的高浓度组中观察到GO在木质部处的点状分布。但由于GO片尺寸较大，一部分GO在导管吸收水分时被阻挡在外，在导管处积累（如图6-12中的GO0.1组）。

（3）SEM表征

根据体视显微镜的分析结果，初步断定GO主要通过对切花木质部的作用（主要是输水导管）对切花的外部形态及生理特性（ROS水平和细胞死亡率）产生影响。木质部在靠近茎边缘的外环位置呈重复分布状态，以下采用SEM对切花茎切口处的几个木质部单元进行表征。

图6-14为花茎刚刚处理后新鲜切口处的SEM图像，可以观察到皮层内侧的若干木质部单元，每一个单元内均含有几个大小不一的孔，即为导管。将其中一个木质部单元放大，可看到导管不规则的排布。导管分为梯纹、环纹、螺纹导管等，其中梯纹导管的管腔较大。

图6-14　切花茎切口处的SEM图像（第0天）

图6-15为第6天不同浓度（0mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L）GO水培切花茎切口处的SEM图像。结果显示，GO0组中茎切口处完全被细菌覆盖，木质部结构无法分辨。细菌污染是切花水培过程中的常见问题，也是切花萎蔫的重要原因。研究表明，细菌会在茎底端快速繁殖，其残体形成生物膜。GO0组中茎的木质部被微生物附着，输水导管被细菌堵塞。对低浓度GO（GO0.1、GO1）组进行观察发现，茎底端切口处的细菌量与GO0组相比明显减少。GO0.1组中木质部的输水导管口清晰可见（图6-15中红色圈指示部分），少量GO呈膜状在导管口处富集（图6-15中黄色圈所示）。高浓度GO（GO100、GO500、GO1000、GO2000）组的茎切口处未发现任何细菌及其分泌物，但GO的大量堆积使得木质部结构无法分辨。堆积的GO片大小不一，分布杂乱无序，且结构松散不紧实。

图6-15

第6天不同浓度（0mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L）GO水培切花茎切口处的SEM图像

SEM表征结果表明，GO显著减少了细菌在木质部的附着。GO对菌种，诸如大肠杆菌、黄单胞菌等细菌具有很强的杀菌活性，对切花培养液中的细菌也可能具有高毒性。为探究GO在培养液中的杀菌活性，水培3d后，利用平板计数法对培养液中的细菌菌落计数，结果如图6-16所示。去离子水的LB培养基中未检测出细菌。GO0组培养液中的菌落数很高，为232×104cfu/mL，而GO0.1组培养液中的菌落数降至33×104cfu/mL。GO1组培养液中的菌落数为9×104cfu/mL，杀菌率高达96.1％。结果表明，低浓度的GO具有很强的杀菌活性，且其杀菌活性具有浓度依赖性。采用Sanger测序法确定了培养液中三种主要的细菌属于青螺菌属和罗尔斯通菌属。

图6-16　培养皿中的菌落照片

已有研究表明，GO在与细菌发生相互作用的同时会被细菌还原。为进一步验证GO与细菌的作用，利用拉曼和XPS对茎底部切口处积累的GO进行表征。

GO的两个主要拉曼特征峰为G峰（约1581cm-1）和D峰（约1350cm-1），分别对应碳sp2杂化结构和含氧官能团的缺陷峰。ID/IG值反映了GO的还原程度，ID/IG值越小，说明GO的还原程度越高。图6-17（a）为改进Hummers法制得的GO的拉曼光谱，其ID/IG值约为1.26。相比之下，GO0.1组和GO1组中GO的ID/IG值均有所下降，分别约为0.94和0.95（图6-17），表明GO杀菌的同时自身被还原。

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图6-17　基部切口处积累的GO的拉曼光谱

对改进Hummers法制备的原始GO和GO500组中茎切口处积累的GO进行XPS检测，C1s光谱如图6-18所示。原始GO的C—C键含量为46.23％，而GO500组中C—C键含量升至54.7％，同样证明了GO发生了还原反应。综上，拉曼和XPS的表征结果间接证明了GO与细菌发生了相互作用。

图6-18

基于以上结果，提出了以下GO对切花外部形态和生理特性的影响机制。

（1）氧化石墨烯积累效应

直接观察、体视显微镜和SEM表征均表明GO附着在切花茎切口处。GO优先在茎切口木质部的导管处积累。随着时间和GO浓度的增加，积累量和积累面积逐渐扩大。在低浓度GO（GO0.1、GO1）组中，GO以薄膜的形式贴附于部分导管口处，而高浓度GO组中GO在茎切口处的积累量大且积累速度快，GO结构松散无序。

GO在木质部的积累与植物吸水性能密切相关。植物对水分的吸收决定了GO的积累方式（如优先在导管处积累等），而GO的积累反之也会对植物吸水产生很大的影响。蒸腾拉力是植物体内水分运输的主要动力，其使切花从培养液中吸收水分，并驱使水分在导管中不断上升。GO溶液在蒸腾拉力的作用下到达导管口处，此时导管类似于一个过滤装置，将GO阻挡在外，水分被导管吸收。

低浓度组的GO量较少，导管可发挥正常的排斥作用，被阻挡的GO在导管口形成滤膜。GO膜较薄且平整，其中的GO片如图6-19（a）所示，其取向有序、排列规整。GO膜具有超快水传输的特性，此时水分子如图6-19（a）中的蓝色箭头所示，可通过片与片之间的缝隙、缺陷孔道及片内疏水通道在GO膜中快速传输，最终进入导管。

图6-19　水分子在木质部导管口GO积累处的传输

高浓度组的GO量较大，GO在导管口会快速大量积累。GO膜逐渐聚集变厚，水通量逐渐降低，导管过滤系统瘫痪。GO的积累不再依靠强蒸腾拉力的作用，片与片之间搭接无序，结构松散，如图6-19（b）所示。此时水分子无法顺畅通过GO进入导管，GO片的杂乱堆积使水分子发生反向运动或形成涡流，严重阻碍了导管对水分的吸收。

（2）氧化石墨烯杀菌效应

已有研究表明，GO主要通过对细胞产生物理损伤和引起细胞的氧化应激反应而对细菌产生毒性。实验中制备得到的GO为片状结构，单层GO的厚度仅约为1nm。超薄的GO片具有锋利的边缘，可对细菌膜造成严重的物理损伤，使细胞内溶质外渗，细胞结构发生变化。同时，GO的XPS和FTIR等表征结果也表明，GO含有大量的含氧官能团，会与蛋白质、DNA等生物分子发生反应，中断电子的运输，干扰细菌的生长和代谢过程，产生大量的ROS，引发细胞氧化应激反应。综上，GO的杀菌机制如图6-20所示。

图6-20　GO的杀菌机制示意图

GO通过多重杀菌机制抑制了培养液中细菌的生长与繁殖再生。对培养液中的细菌分析发现，低浓度的GO对青螺菌和罗尔斯通菌具有很强的杀菌活性。0.1mg/L GO的杀菌性能为85.8％，1mg/L GO的杀菌性能为96.1％。拉曼和XPS的表征结果也间接证明了GO的杀菌性能，其减少了细菌在茎切口木质部导管处的积累，进而减缓了细菌繁殖对切花水分吸收的干扰、改善了水培环境而间接对切花产生积极作用。

综上分析可知，GO主要通过在茎切口处的积累效应和对培养液中细菌的杀菌效应对木质部导管的吸水性能产生影响，进而对切花的外观和生理特性产生影响。图6-21（a）为切花的水分代谢示意图。切花体内的水分以水蒸气的形式从体表流失，在蒸腾拉力的作用下，切花通过茎底端木质部的导管吸收水分，以维持花瓣膨压，防止切花衰老。导管口堵塞则意味着切花的吸水途径被切断，水分代谢受到干扰。切花细胞内的ROS水平增加，产生氧化应激反应，导致细胞死亡率升高，外观上则表现为萎蔫衰亡。

新鲜切花茎切口处的木质部导管口清晰可见[图6-21（b）]。水培一段时间后，木质部导管处发生微生物附着，水吸收通道被阻塞，导致水代谢失衡[图6-21（c）]。少量的GO具有较高的杀菌活性，大幅度减缓细菌在导管处的附着。同时GO会在部分导管处形成薄膜，GO膜的超快水传输性能为切花输送充足的水分[图6-21（d）]。而过量的GO会导致大量且不规则的GO片堵塞导管，使水分子无法通过，最终使切花提早萎蔫[图6-21（e）]。

图6-21

（a）切花的水分代谢示意图；（b）新鲜切花茎切口处的木质部导管口结构示意图；（c）细菌附着导管口示意图；（d）少量GO在导管口处积累的示意图；（e）过量GO在导管口处积累的示意图

对主要的水分代谢指标[水分吸收量（Water Uptake，WU）、相对鲜重（Relative Fresh Weight，RFW）、水分平衡值（Water Balance Value，WBV）、相对含水量（Relative Water Content，RWC）]进行测试，进一步验证GO对切花的影响机制。

测试结果如图6-22所示。不同条件下WU的测试结果与前面的机制分析一致。与GO0组相比，低浓度GO（GO0.1、GO1）组中的切花样品具有较高的WU，这主要源于GO的杀菌效应和GO膜的水传输特性。而高浓度GO（GO100、GO500、GO1000、GO2000）组中切花样品的WU始终保持在一个很低的范围之内，这主要是因为大量GO在导管处积累使导管发生了堵塞。

图6-22

不同浓度（0mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L）GO水培切花月季的水分代谢指标变化（结果为平均值±标准差，样品数n=3）

切花的WU直接决定了其他几个水分代谢指标的对应结果。与GO0组样品相比，WU较高的低浓度GO（GO0.1、GO1）组中的切花具有较高的RFW。相反地，高浓度GO（GO100、GO500、GO1000、GO2000）组中切花的RFW低于GO0组，且随瓶插时间的增加下降很快。GO0组、GO0.1组、GO1组和GO10组的WBV变化趋势相似，其中GO0.1组的WBV最高。而高浓度GO（GO100、GO500、GO1000、GO2000）组中切花在水培1d后WBV低至-2.5。WBV是吸水量与失水量的差值，吸水量过低导致切花的失水量远大于吸水量，这与切花在水培第2天发生萎蔫的现象一致。随后几天WBV有所回升，主要是因为切花缺水萎蔫失水量有所降低。RWC也是水分代谢的一个重要指标，高RWC使花瓣保持较高的膨压。GO0组中花瓣的RWC随瓶插时间增加而持续下降，相比之下，GO0.1组和GO1组中花瓣的RWC较高，且在水培前2天有所增加。GO10组中花瓣的RWC随时间的变化与对照组类似。GO100组、GO500组、GO1000组和GO2000组中花瓣的RWC在水培前4天显著下降，其值明显低于GO0组。

以上结果验证了GO对切花的影响机制，GO主要通过影响木质部导管处的堵塞情况进而影响切花的水分代谢，这种水胁迫环境会进一步影响细胞的ROS水平和死亡率，最终影响切花的外部形态（瓶插寿命和观赏价值）。

为进一步探究低浓度GO对切花月季的影响趋势，将GO的浓度在0～1mg/L进行细化。利用0mg/L、0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.15mg/L、0.5mg/L、1mg/L的GO水溶液（GO0、GO0.01、GO0.05、GO0.1、GO0.15、GO0.5、GO1）水培切花月季，并从其外部形态、GO/茎切口界面和水分代谢指标几个方面进行分析。

拍照记录切花月季的外部形态，如图6-23所示。GO0.01组与GO0组中切花的盛开情况相近。在水培第4天，大部分切花出现萎蔫症状。GO0.05至GO1组中切花的开放时间均比GO0组长，其中GO0.1组和GO0.15组的盛花期延长效果最为显著。

图6-23

不同浓度（0mg/L、0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.15mg/L、0.5mg/L、1mg/L）GO水培切花月季的照片（0～6d）

对每组条件下10枝切花的瓶插寿命和花径比值进行统计，具体结果如图6-24所示。与GO0组中切花的瓶插寿命（4.0d）相比，GO0.1组和GO0.15组中切花的瓶插寿命延长至5.7d，效果显著。其他组中GO对切花的瓶插寿命也稍有延长，按效果由强到弱排序依次为GO0.5组、GO1组、GO0.01组、GO0.05组。对切花的花径比值结果进行分析，水培前2天所有组中的花径比值均呈上升状态，说明切花处于盛开期，其中GO0组的花径比值略低。水培第3天，仅GO0组的花径比值开始下降，说明该组切花开始衰败。GO0.1组与GO0.15组的花径值在前4天一直保持上升趋势，切花始终处于盛花期。GO0.01组的切花在水培第4天时具有较高的花径比值，这是因为该组切花已经凋零，花瓣散落，测得的花径值较大，但切花已不具备观赏价值。

图6-24

（a）不同浓度（0mg/L、0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.15mg/L、0.5mg/L、1mg/L）GO水培切花月季的瓶插寿命（结果为平均值±标准差，样品数n=10）；（b）不同浓度（0mg/L、0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.15mg/L、0.5mg/L、1mg/L）GO水培切花月季的花茎比值变化（结果为平均值±标准差，样品数n=10）（0～4d）

对切花茎切口处进行观察，具体结果如图6-25所示。第0天的新鲜茎切口干净无污染，经过6d的水培后，茎切口处略变浑浊。GO0.01组、GO0.05组、GO0.1组、GO0.15组中无肉眼可见的GO积累，GO0.5组和GO1组中可观察到GO在切口外环处有少量积累。

图6-25

（a）水培切花茎切口处照片（第0天）；（b）水培切花茎切口处照片（第6天）；（c）（d）水培切花茎切口处体视显微镜表征照片（第3天）；（e）（f）水培切花茎切口处体视显微镜表征照片（第6天）;（c）（e）中的标尺为1mm，（d）（f）中的标尺为400μm

图6-25（c）（d）所示为水培3d后不同条件下切花茎切口的体视显微镜表征照片。GO0.5组和GO1组中，GO在部分木质部的导管处有所积累。GO0.01组中，木质部浑浊程度高，污染严重。图6-25（e）（f）为水培6d后不同条件下切花茎切口的体视显微镜表征照片。GO0.5组和GO1组中，GO在导管处积累增多，颜色加深。GO0.1组和GO0.15组中，有少量GO在部分导管处积累。GO0组样品中，切口处木质部污染最为严重，虽无GO的加入，但导管处仍出现棕黑色污染物。

利用SEM进一步观察切花茎切口处的木质部，GO0组、GO0.05组、GO0.1组、GO0.15组的SEM图像如图6-26所示。仅水培3d，GO0组中茎的木质部即有大量细菌附着，可明显观察到起伏的细菌及其分泌物，极少数的输水导管口暴露在外。GO0.05组的细菌附着情况与GO0组类似，暴露的导管口稍多一些，这说明0.05mg/L的GO杀菌活性较弱。相比之下，GO0.1组和GO0.15组的细菌量明显减少，GO开始发挥其杀菌性能，大部分输水导管口暴露在外。GO0.15组中部分导管口处有平整的GO膜贴附，在结构上与GO0组的细菌生物膜有明显差异，很容易分辨。

图6-26

不同浓度（0mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.15mg/L）GO水培切花茎切口处的SEM图像（第3天）

对切花的WU进行测试，结果如图6-27所示。GO0.1组和GO0.15组中切花的WU相对较高。从SEM表征结果可以看出，这两组茎切口处的木质部导管洁净，仅有少量有水传输性能的GO膜积累，其WU较高。因此这两组切花具有较长的瓶插寿命，且其花径比值呈上升趋势。其他组的WU相差不大，GO0.5和GO1组的WU略高于GO0组、GO0.01组和GO0.05组。GO0.01组和GO0.05组中GO的浓度极低，无法抑制细菌繁殖，细菌对导管堵塞严重，导致WU较低。GO0.5组和GO1组虽然有更好的杀菌活性，但是GO过量积累会造成导管堵塞。综上，在0～1mg/L浓度区间，WU随着GO浓度的增加先增加再减少。

图6-27

不同浓度（0mg/L、0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.15mg/L、0.5mg/L、1mg/L）GO水培切花月季的水分吸收量变化（结果为平均值±标准差，样品数n=3）

切花的RFW和WBV随瓶插时间的变化结果如图6-28所示。与WU的结果相对应，高WU的GO0.1组和GO0.15组具有较高的RFW和WBV，且变化趋势比较接近。浓度极低的GO0.01组和GO0.05组与GO0组的RFW和WBV非常接近，且变化趋势也相同。GO0.5组和GO1组的RFW和WBV稍高一些，处于中间水平。

图6-28

不同浓度（0mg/L、0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.15mg/L、0.5mg/L、1mg/L）GO水培切花月季的水分代谢指标变化（结果为平均值±标准差，样品数n=3）