果蝇学习记忆的重要机制与蘑菇体密切相关

在进一步探讨学习记忆的分子机制和精细神经网络时，人脑样品面临着严重的局限性，因此模式动物的开发进入了科学家的视野。海兔、果蝇、小鼠、大鼠等模型陆续出现。果蝇无疑是其中最耀眼的一个，其无可比拟的遗传操作优势，将学习与记忆的机制研究提升到了新的高度。

果蝇的选择学习（夏源　图）

早在1940年，特赖恩（R.C.Tryon）设计了一个食物迷宫来挑选每世代大鼠中最先找到食物的“精豆”和最慢学会路线的“呆瓜”，并分别繁育。结果发现，“精豆”和“呆瓜”们对于迷宫的学习能力，差异越来越明显。因此，他提出学习与记忆的能力跟个体遗传差异相关的假设。而直到更加严格的数量遗传学实验在果蝇和它的近亲绿头苍蝇中完成，遗传基因差异性影响学习与记忆能力的论点，才逐渐被人们接受。并且基于“孟德尔定律”，科学家认识到苍蝇中“精豆”和“呆瓜”的学习与记忆能力差异，是多基因介导的多线程复杂过程。

之后，得益于单基因化学诱变和大规模正向遗传筛选在果蝇中的广泛应用，在学习与记忆中的单基因功能解析迎来了井喷之势。著名的美国生物物理学家本泽（S.Benzer,1921—2007年）率先开创了以果蝇为主要模型的神经遗传学研究。1974年，本泽实验室建立了第一个果蝇嗅觉依赖的刺激回避学习模型（olfactory shock-avoidance learning assay）。野生型果蝇通过给予某种“危险”气味时伴有电击惩罚的训练，可以在后续的记忆检测中，自主选择进入含有“安全”气味的管子，而规避“危险”气味的管子。利用该筛选系统，本泽团队在加州理工学院定位了第一个学习基因——dunce，意为“傻瓜”。很快，生化实验提供了完整的证据，发现该基因是cAMP信号通路中重要的催化酶，进而揭示了从果蝇到人类都十分保守的学习与认知核心信号通路——cAMP信号通路。1985年本泽的学生奎因（W.G.Quinn）以及奎因的学生图利（T.Tully）完善了果蝇的嗅觉学习模型，构建了经典的巴甫洛夫嗅觉学习模型（Pavlovian olfactory learning assay），可以方便地量化统计气味训练以后的果蝇在T型迷宫中自主选择“安全”气味的比例。利用这些系统，奎因和图利先后在普林斯顿和布兰迪斯陆续筛选到另外7个围绕该信号通路的关键学习基因。

果蝇巴甫洛夫嗅觉学习装置

［引自Tully T,Quinn W G.Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster.J
Comp Physiol A,1985,157(2): 263—277］

行为是一个复杂的过程，只能间接反映学习记忆的能力，单纯的行为筛选有着明显的不足。如果某个基因突变的果蝇不能通过某个行为模型的检测，绝不能简单地认为，该基因就一定参与了相关学习与记忆的调控。鉴于此，门泽尔（R.Menzel）和埃贝尔（J.Erber）团队最早从解剖学角度，尝试解析参与学习记忆的昆虫功能脑区。他们在1978年发现，对气味训练后蜜蜂的蘑菇体^[1]（类似于人脑海马体）区域，立即进行局部冷冻，可以引发退行性失忆症。之后，来自德国维尔茨堡的海森贝格（M.Heisenberg）研究组，在果蝇中筛选和定位了很多脑部发育基因，如minibrain突变伴有果蝇蘑菇体萎缩。这些导致果蝇脑的蘑菇体或中央复合体结构不全的基因突变，同样会引起果蝇气味学习能力的缺陷。此外，贝勒医学院的戴维斯（R.L.Davis）研究组，利用果蝇基因增强子检测（enhancer-detector）技术，在果蝇脑内将诱导表达的基因用荧光等手段标记出来。他们证实了之前鉴定的学习基因，大都表达在果蝇的蘑菇体中。如果使用羟基脲喂食特定发育窗口的果蝇幼虫，从而消除成虫的蘑菇体，或者在蘑菇体中而不是在中央复合体中阻断cAMP信号通路，都会造成果蝇巴甫洛夫气味学习能力的丧失。这些在果蝇中的发现，首次验证了蘑菇体是气味学习的功能脑区，其中的cAMP信号通路对于气味的学习与记忆是必需的。

近年来，果蝇视觉、味觉、触觉等其他的学习记忆模型也逐渐建立和成熟起来。比如布伦布斯（B.Brembs）搭建了视觉学习模型，通过记录果蝇对不同视觉图形的“左转”或“右转”选择，发现视觉记忆依赖于蘑菇体之外的功能脑区。

学习能力的考虑必然伴随着记忆能力的检测。记忆组分的上下游遗传分析，率先在果蝇中得以完成，暂分5个阶段：获知（acquisition or learning,LRN）；短期记忆（short-term memory,STM）；中期记忆（middle-term memory,MTM）；抗麻醉记忆（anesthesia-resistant memory,ARM）；长期记忆（long-term memory,LTM）。

果蝇视觉学习装置

［引自Brembs B,Wiener J.Context and occasion setting in Drosophila visual learning.Learn Mem,2006,13(5): 618—628］(www.xing528.com)

记忆的5个不同阶段和调控基因

［引自Margulies C,Tully T,Dubnau J.Deconstructing memory in Drosophila.Current Biology,2005,15(17):R700—R713］

LTM是记忆形成的最终稳定形式，依赖于新蛋白质的合成，因为图利在1994年发现蛋白质合成抑制剂可有效阻断LTM的形成。更重要的是他们发现，有间歇的交替训练，而不是一味的连续训练，更能促进LTM的形成。因此，“劳逸结合”才是最佳的学习策略。

殷（J.C.P.Yin）等人随后在1995年的《细胞》（Cell）杂志上提出，CREB（cAMP应答组件结合蛋白）基因所转录的激活亚型和抑制亚型的比例，控制了LTM的形成。他们认为，虽然激活亚型和抑制亚型在果蝇训练期间都能诱导表达，但只在休息间歇，两者呈现不同的功能强度。因此，LTM最终体现为激活亚型主导的记忆形成在每个训练周期的累积。

一个有意思的插曲是，殷在该论文中表明，单独过表达CREB激活亚型，足以加强果蝇LTM的形成；反之，过表达抑制亚型可以有效地阻断LTM的形成。然而，2004年戴维斯在《神经科学杂志》（The Journal of Neuroscience）上提出质疑，认为过表达激活型对LTM的加强没有效果。2013年，殷同样在该杂志上进行了反驳，并强调转基因过表达和起始训练的间隔窗口，对于该表型的呈现至关重要。

记忆在最终强化为稳定的LTM之前是很不稳定的。例如，人们可用冷刺激轻易消除果蝇刚刚在嗅觉训练中形成的记忆。可图利在1994年发现，在训练后最初2小时内，同时有一种冷刺激不敏感的记忆形成，被称为ARM。和LTM不同，ARM不依赖于新蛋白质的合成，但也会随时间而消退。有趣的是，10次连续训练和10次间隔性训练所能产生的最大ARM是相同的。因此，ARM可定义为持续训练所能形成的最持久的记忆。ARM和LTM在间隔训练后的几天内，是两种平行存在的长时记忆形式，但两者无论在调节基因上还是在功能上都是相互独立的。如ARM不受CREB调控，却依赖于rsh基因，而rsh又不会影响LTM。

在训练的2小时内，即使当ARM达到最高点时，仍有近50%的记忆是冷刺激敏感的。它们同样不依赖于蛋白质合成，也是一种记忆的不稳定形式，被称为MTM。图利分别在1990和1996年设计了非常巧妙的果蝇嗅觉学习实验，证实了MTM的存在。首先，各组果蝇同时接受初次训练，气味A伴随着电击，气味B没有。然后，各组果蝇在间隔不同时间后，进行2次颠倒训练，气味B伴随电击，而A不伴随，之后立即检测果蝇在T形迷宫中对气味A和B的选择情况。

理论上存在两种极限情况。若颠倒训练完全打破初次训练，马上检测的结果就是各组果蝇规避气味B的比例一致，并且和初次训练后马上检测，规避气味A的比例一样。而若颠倒训练完全不影响初次训练，那么规避气味A的果蝇比例将按正常的记忆衰减规律随时间逐渐降低，选择气味B的比例逐渐上升。实际上，野生型果蝇的表现恰好处在两种极端情况之间，也就是在这2小时内，有一种可部分干扰颠倒训练对新记忆塑造的中期记忆的形成。

目前人们对STM还不甚了解，但在果蝇中发现，dnc和rut基因突变会造成果蝇30分钟内的训练记忆快速消退，而可阻断MTM形成的amn基因突变，不会影响这种短期记忆。这说明，至少还有一种记忆形式存在于MTM的上游，被称为STM。至于LRN，则特指起始的学习认知阶段。有些果蝇的突变体如lat、lio和PKA—RI，虽然具有正常的记忆留存能力，但在初期气味学习中呈现出严重的能力缺陷。