食品加工技术实训：第四节典型发酵食品

实训一　米曲霉的分离

（一）实训目的

通过实训，了解米曲霉菌落特征，掌握米曲霉的培养分离原理与技术。

（二）实验原理

在分类学上这一菌群分为两大组即黄曲霉和米曲霉。它们的区别在于前者小梗多为二层，后者小梗多为一层。由于黄曲霉有些品种产生具有强致癌作用的黄曲霉毒素，一直被禁用。酿造工业生产，目前多选用米曲霉，如蛋白酶活力较强的可用于酱油酿造，糖化酶较强的种多用于黄酒生产。由于分离目的不同，分离材料可选自酿造厂中使用的优质种曲。

（三）实验设备及器材

高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、分光光度计、天平；烧杯、量筒、培养皿、三角瓶、玻璃珠、移液管、试管、涂布器、酒精灯、接种环、纱布等。

（四）实验材料

1.样品

优质酱油种曲。

2.培养基

（1）豆芽汁培养基（斜面保存用）　黄豆芽500 g，加水1000 mL，煮沸1 h，过滤后补足水分，121℃湿热灭菌后存放备用，此即为50%的豆芽汁，用于细菌培养：10%豆芽汁200 mL，葡萄糖（或蔗糖）50 g，水800 mL, pH7.2～7.4。用于霉菌或酵母菌培养：10%豆芽汁200 mL，糖50 g，水800 mL，自然pH。霉菌用蔗糖，酵母菌用葡萄糖。

（2）酪素培养基（粗筛分离用）　分别配制A液和B液。

A液：称取Na2HPO4·7H2O1.07g。干酪素4g，加适量蒸馏水，并加热溶解。

B液：称取KH2PO40.36g，加水溶解。

A、B液混合后，加入酪素水解液0.3 mL，加琼脂20 g，最后用蒸馏水定容至1000 mL。酪素水解液的配制：1 g酪蛋白溶于碱性缓冲液中，加入1%的枯草芽孢杆菌蛋白酶25 mL，加水至100 mL，30℃水解1 h。用于配制培养基时，其用量为1000 mL培养基中加入100 mL以上水解液。

（五）实验方法与步骤

1.取种曲一小块，于20 mL带玻璃珠的无菌水三角瓶中，用力振荡使其分散均匀。用数层无菌纱布过滤，收集滤液于一无菌试管中，适当稀释，使其孢子浓度为（3～5）×102孢子/mL。

2.熔化酪素琼脂培养基，稍冷却至50～60℃后，取孢子悬浮液0.1 mL于平板上，用无菌涂布器依次涂布2～3个皿。于32℃培养24～48 h。

3.挑选相对透明圈大的菌落于豆芽汁斜面培养基上，32℃培养3 d，斜面长满孢子。4℃冰箱保存备用。

4.性能测定，即测定米曲霉蛋白酶活力，具体方法如下：

（1）将菌株斜面1环，接种于三角瓶麸曲培养基中，摇匀，于32℃培养30小时。吸取滤液1 mL，用适当的缓冲液（0.02 mol/L pH7.0磷酸缓冲液）稀释一定的倍数（如10、20或者30倍）。

（2）绘制标准曲线。

①取试管7支，编号，按照表4-2-2加入试剂。单位：mL。

表4-2-2　标准曲线绘制

②摇匀，置于40℃恒温水浴中显色20 min。

③用分光光度计在波长为660 nm处测定OD值。

④以光吸收值为纵坐标，以酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线。

（3）蛋白酶活性的测定。

①取试管三支，编号，每管中加入酶样品稀释液1 mL，40℃水浴锅中预热2 min，再加入同样预热的1.0%酪蛋白1 mL，精确保温10 min，立即加入0.4 mol/L的三氯乙酸2 mL，以终止反应，继续保温20 min，待残余蛋白质沉淀后过滤。

②同时另做一对照试管，取酶样品稀释液1 mL，三氯乙酸2 mL，摇匀，然后再加入1.0%酪蛋白1 mL，保温10 min，保温放置20 min，过滤。

③然后另取三支试管，编号，每管内加入滤液1 mL，再加入0.4 mol/L的碳酸钠5 mL，以中和剩余的三氯乙酸，加入已稀释的福林试剂1 mL摇匀，40℃保温发色20 min，用分光光度计测定OD值（波长660 nm）。同时另取两管做B滤液对照和蒸馏水空白对照。

（4）计算　在40℃下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为一个酶活力单位。样品蛋白酶活力：

单位（湿基）=（A×4n）/（10×5）

式中：A——由样品测定OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数；

4——4 mL反应液取出1 mL测定；

n——稀释倍数；

10——反应10 min。

（六）思考题

1.记录分离菌株的菌学特征。

2.怎样区别米曲霉与黄曲霉。

实训二　高产蛋白酶酱油米曲霉的选育

（一）实训目的

通过实训，掌握菌种的物理、化学因素诱变育种基本技术；通过诱变育种技术筛选出高产蛋白酶菌株。

（二）实验原理(www.xing528.com)

本实验采用紫外线、硫酸二乙酯（DES）、亚硝酸胍（NTG）及Co60-γ射线等物理、化学因子，单独或复合处理沪酿3.042菌株的分生孢子，选育出一株其三角瓶麸曲蛋白酶活力比出发菌株有较大幅度提高，蛋白酶活力稳定在8000单位/克麸曲（F）以上的菌株。

（三）实验设备及器材

诱变箱、曲盒、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、分光光度计、天平、烧杯、量筒、培养皿、三角瓶、玻璃珠、移液管、试管、涂布器、酒精灯、接种环、纱布等。

（四）实验材料

1.菌种

米曲霉（Asp.Oryzae）沪酿3.042。

2.培养基

（1）豆芽汁培养基（斜面保存用）　同实训一。

（2）酪素培养基（粗筛分离用）　同实训一。

（3）三角瓶麸曲培养基（复筛用）　冷榨豆饼55%，麸皮45%，水分90%（占总料量的百分数），充分润湿混匀，每300 mL三角瓶装湿料20 g，于0.12 MPa灭菌25 min。

3.其他试剂

①pH6.0磷酸缓冲液。

②pH7.0磷酸缓冲液。

③0.01%、0.05%SDS溶液。

④25%Na2S2O3溶液。

（五）实验方法与步骤

1.出发菌株的选择

使用生长快，适用固体曲培养，蛋白酶活力较高的沪酿3.042菌株。经分离纯化转到豆芽汁培养基斜面，培养5～7 d，待孢子丰满备用。

2.诱变处理

（1）紫外线（UV）处理。

孢子悬浮液制备：在生长良好的纯种斜面中，加入5 mL的0.05%SDS溶液，洗下孢子，移入装有10 mL的0.01%SDS溶液和玻珠的150 mL的三角瓶中，振荡使孢子充分散开，使用脱脂棉过滤至装有30 mL 0.01%SDS溶液的三角瓶中。用血球计数板计数，调整孢子浓度为106个/mL。

诱变处理：取10 mL孢子悬浮液于90培养皿中（带磁棒），置于诱变箱磁力搅拌器上，具体操作方法：

①开启紫外线灯，预热20 min后，开启磁力搅拌器，打开皿盖，分别照射4 min、6 min、8 min、12 min、16 min、20 min。

②取不同时间诱变处理的菌液1 mL，逐步稀释为101、102、103、104，作适当稀释（每平板10～12个菌落为宜），测定处理液中存活细胞浓度（每时间作3个稀释度，每1稀释度作3皿平行），将结果填入表4-2-3。

③取上述同样的稀释菌液0.1 mL，置于平皿中，倾入熔化并冷却至45～45℃的酪素培养基15 mL，充分混匀，凝固后置于32℃培养48 h，或者取上述同样的稀释菌液0.1 mL，涂布于酪素平板，32℃培养48 h，计算每皿菌落数（每稀释度做3皿平行）。之后计数每毫升处理液中的回复突变细胞浓度，将结果填入表4-2-4，同时做原出发菌株细胞自发回复突变率。在测定自发回复突变率的平板上不形成菌落为正确。

④绘制细胞存活率和突变率曲线。

表4-2-3　紫外线对米曲霉孢子存活率的影响

表4-2-4　细胞回复突变率

（2）硫酸二乙酯（DES）及DES和LiCl复合处理。

①DES处理：用pH7.0磷酸缓冲液制备孢子浓度为106个/mL的孢子悬浮液。取32mLpH7.0磷酸缓冲液，8mL孢子悬浮液、0.4mLDES溶液充分混匀（DES的浓度为1%，v/v），30℃恒温振荡处理10min、20min、30min、60min后，分别于1mL处理液中加入0.5mL25%Na2S2O3溶液终止反应。分别取1mL做适当稀释后，各取0.1mL菌液，涂布于酪素培养平板上，32℃培养48h。

②DES和LiCl复合处理：将经DES处理的孢子悬浮液0.2 mL，涂布于含有终浓度为0.5%LiCl的酪素培养平板上，于32℃培养48 h。

（3）亚硝基胍（NTG）处理。

①孢子悬浮液制备：使用经上述诱变剂处理选择的、蛋白酶活力有显著提高的优良菌株。以pH6.0磷酸缓冲液制备孢子浓度为106个/mL的孢子悬浮液（具体方法同上）。

②诱变处理：精确称取4 mg NTG，加入2～3滴胺甲醇溶液，于水溶液中充分溶解后，加入4 mL孢子悬浮液（使NTG终浓度为1mg/mL），充分混匀后，于恒温水浴中振荡处理30、60、90 min。立即分别取1 mL处理液作大量稀释以终止NTG的诱变作用，取最后稀释度的菌液0.1 mL，涂布于酪素培养平板上，32℃培养48 h。

（4）Co60-γ射线处理。

①孢子悬浮液制备：使用经NTG处理、选择的高产蛋白酶菌株，用生理盐水制备孢子浓度为106个/mL的孢子悬浮液。

②诱变处理：分别取10 mL孢子悬浮液于试管中，处理前于32℃恒温振荡培养10 h，使孢子处于萌发前状态，分别以剂量6万、8万、10万、12万、14万、16万Gy伦琴射线处理。将处理液适当稀释，分别取0.1 mL，涂布于酪素培养平板上，32℃培养48 h。

3.筛选方法

（1）初筛（透明圈法）　以酪素平板上菌落周围呈现的酪素水解的透明圈直径与菌落直径之比值（HC值）作为初筛的指标，即初步判断突变株产生蛋白酶活力的高低，其操作方法如下：

准确吸取10 mL琼脂培养基于平皿中，摇匀凝固（一定要水平）。在其上精确的注入15 mL酪素培养基，摇匀凝固后备用。准确吸取0.1 mL上述处理液于平板上，用涂布器涂布均匀，于32℃培养48 h，测定菌落周围呈现的酪素水解的透明圈和菌落直径，并计算比值。将比值大的菌落挑入斜面，32℃培养4～5 d，待长好后于冰箱中保存，作为复筛菌株，每一诱变因素挑选200个菌落。

（2）复筛（三角瓶麸曲培养）　将初筛获得的菌株斜面1环，接种于三角瓶麸曲培养基中，摇匀，于32℃培养12～13小时，麸曲表面呈现少量白色菌丝时，进行第一次克瓶（即摇动瓶子，使物料松散，以便排出曲料中的CO2和降温，有利于菌丝生长），继续培养至18 h，进行第二次克瓶，之后继续培养至30 h止。测定麸曲中的中性、碱性、酸性蛋白酶含量，每一诱变因子初筛得到的菌株，经复筛后选择5株优良菌株，作为另一诱变因子处理时的出发菌株。

（六）思考题

1.在选择平板上形成蛋白透明水解圈大小为什么不能作为判断菌株产蛋白酶能力的直接证据？

2.菌种诱变后为何要放在暗箱培养一段时间？