细菌杀虫剂改为微生物学在杀虫剂中的应用

细菌杀虫剂（bacterial insecticide）是利用对某些昆虫有致病或致死作用的杀虫细菌及其所含有的活性成分制成。 目前筛选的杀虫细菌有100 多种，其中被开发成产品投入实际应用的主要有4 种，即苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis， Bt）、日本金龟子芽孢杆菌（Bacillus popilliae）、球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus）和缓病芽孢杆菌（Bacillus lentimorbus），其中苏云金芽孢杆菌是当今商业开发最为成功、效果最好、产量最多、应用面积最大的广谱细菌杀虫剂，由日本微生物学家Ishiwatari 博士，于1901 年在家蚕染病幼虫的体内分离得到。 我国于1950年引进苏云金芽孢杆菌以后又相继分离出杀螟杆菌、青虫菌、松毛虫杆菌等。

（1）作用机制

苏云金芽孢杆菌，其制剂简称Bt 制剂，是一种革兰氏染色阳性，产伴胞晶体，能寄生于昆虫体内并引起虫体发病的芽孢杆菌。 其对昆虫的致病作用主要依靠芽孢和毒素。 苏云金芽孢杆菌在菌体的一端形成芽孢，在另一端形成近菱形的蛋白质晶体，即伴孢晶体。 不同苏云金芽孢杆菌菌株的伴孢晶体所含的晶体蛋白种类和数量差异很大，通常含有1 ～5 种杀虫晶体蛋白，其相对分子质量为2.70 ×104 ～1.40 ×105）。 目前已知的苏云金芽孢杆菌毒素有4 种，即δ-内毒素（晶体毒素、前毒素，是一种碱性蛋白质）、β-外毒素（苏云金素，一种热稳定性核酸衍生物）、α-外毒素（一种卵磷脂酶）和γ-外毒素。

β-外毒素是一种非特异性的小分子腺嘌呤核苷酸衍生物，相对分子质量约为700，溶于水。 β-外毒素比δ-内毒素热稳定性强，可耐受121 ℃、15 分钟，作用机制和致病症状也不相同，β-外毒素是RNA 聚合酶的竞争性抑制剂，干扰与昆虫发育有关的激素合成，导致幼虫发育畸形或不能正常化蛹，苏云金芽孢杆菌的芽孢被昆虫吞食后，在肠道中萌发成营养体，大量增殖，并穿透肠壁进入血液，导致昆虫因败血症死亡。

敏感昆虫吞食各类苏云金芽孢杆菌后的症状:食欲减退、停止取食、行动迟钝、上吐下泻，1 ～2 天死亡。 死后虫体软化变黑，进而腐烂发臭。

（2）Bt 制剂的生产

Bt 制剂的商品化生产通常采用传统的深层液体（或固体）发酵，培养基成分简单，发酵工艺粗放。 开发廉价的发酵培养基、缩短发酵周期和提高单位体积发酵罐的毒素产量是研究者的重要课题。

液体发酵培养基配方:豆饼粉1%、鱼粉或蚕蛹粉0.5%、葡萄糖1%、硫酸铵0.2%、玉米浆0.2%、磷酸二氢钾0.1%、碳酸钙0.5%、豆油少量，pH 6.6 ～7.0， 培养温度33 ～35 ℃，培养时间20 小时，菌数≥2.00 ×109 cfu/mL。 液体发酵一般将发酵液制成液体制剂或者将发酵液喷雾干燥。 其生产工艺流程:

斜面菌种→克氏瓶培养→三角瓶液体培养→发酵罐→添加吸附剂→浓缩→喷雾干燥→产品检验→包装。

固体发酵培养基配方:麦麸70%、黄豆饼粉20%、谷壳9%、碳酸钙1%、料水比为1∶0.8 ～1∶1.2，石灰水调pH 值至9，培养基的含水量以手捏成团，松开即散为宜。 培养基灭菌后接种Bt 菌种，拌匀后，把料松散平摊在曲盘或帘子上，厚度为1.5 ～3.3 cm，上面覆盖1 ～2 层灭过菌的湿纱布。 培养初期菌体大量繁殖，料温28 ～32 ℃，室温24 ～26 ℃， 相对湿度80%左右。芽孢开始形成后，室温和料温应适当提高，料温维持在35 ～37 ℃。 加大通气量，定时翻料、放潮，促使菌体生长成熟。 一般培养48 小时左右，当芽孢形成率不再增长并有20%左右的芽孢脱落时，即可终止发酵。 可获得含活芽孢数约2.00 ×1010 cfu/g 的产品。

（3）Bt 制剂的应用(www.xing528.com)

Bt 制剂广泛应用于防治农林害虫、仓库储存害虫和卫生害虫。 主要用于防治菜粉蝶、小菜蛾、稻苞虫、黑点刺激等，对鳞翅目、膜翅目、双翅目、直翅目等200 多种昆虫幼虫都有毒杀作用。 剂型有粉剂、水剂、颗粒剂、乳剂和胶囊剂等。 可采用喷雾、喷粉、泼浇、撒粉等方式防治害虫。 苏云金杆菌对人、畜、禽、水产无害，对作物无毒，尤其适用于飞机喷撒。 与合成的化学杀虫剂混合使用，能发挥生物杀虫剂的最大效力。 但它对家蚕等有致病作用，故蚕区禁用。 万一误喷，用0.3%的漂白粉消毒3 分钟即可解除毒性。

（4）Bt 制剂的特点

①对人畜安全无毒。 大量试验表明，通过各种感染途径，苏云金芽孢杆菌对小白鼠、豚鼠、兔、猴、鱼类及人类均无不利影响。 苏云金芽孢杆菌对人类无毒害，主要是由于伴孢晶体需在昆虫肠道的碱性条件和特异性的碱性蛋白酶作用下才能降解为毒性成分。 而哺乳动物胃内的环境为酸性，甚至在胃蛋白酶和胃酸的作用下，把有毒成分转变为无毒状态。 所以Bt 制剂对昆虫有毒性，而对脊椎动物无毒性。

②对作物无毒害。 在Bt 制剂的正常应用中，即使浓度比正常浓度高几十倍，也未曾发现对作物产生药害的报道。

③不杀伤害虫天敌，维护生态平衡。 化学杀虫剂无选择性，在杀死害虫的同时也杀伤了天敌和有益生物。 而在野外应用Bt 制剂，除害虫致死外，对天敌和有益生物无影响，这样害虫的天敌数量能维持在一个较高水平，将害虫控制在经济阈值以下。

④害虫不易产生抗药性。 不同血清型的亚种，甚至同一亚种的不同菌株，可产生不同的杀虫晶体蛋白，由于其作用位点不同，可有效克服或延缓抗性的产生。 有报道，小菜蛾的抗药性是因为Bt 制剂作为单一农药长期使用，害虫在数年的极端选择压力下产生的。

（5）Bt 制剂的研究开发

Bt 制剂虽然具有很多优点，但也存在不足。 例如，选择性强、杀虫谱较窄；杀虫效果受环境影响大；必须经过吞食进入昆虫体内才能将其杀死；害虫达到死亡高峰期较慢；毒素需在一定的温度下发挥杀虫效力， 在自然条件下活性丧失；对蚕有毒性；昆虫对Bt 制剂逐渐产生可遗传的抗性。 这些不足之处可采用各种方法补救，最重要的是用遗传工程的手段改造苏云金芽孢杆菌。 使重组的苏云金芽孢杆菌毒力增强，也使孢子结晶复合体对恶劣环境具有更大的耐受力，从而增加杀虫剂的效果。 为了保护生态，重组的工程菌必须同时满足既不杀害益虫又不会长时间存留在环境中的要求，即必须保留对人类、非靶标生物及环境安全的特性。

遗传工程应用在Bt 制剂上的主要研究工作包括:开发可使通常的Bt 基因表达出不同寄主谱的接合体菌株；将具有不同寄主谱的Bt 互相融合在一起的融合体的构建；直接修饰特定区域以改善或扩展寄主谱；开发能够表达Bt 基因的转基因微生物或转基因植物。

将苏云金芽孢杆菌内毒素基因克隆到荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens，一种根寄生菌）的染色体DNA 上，这种菌在玉米根系周围土壤中定植，使玉米根系免遭鳞翅目幼虫的危害。 比利时植物遗传系统公司（Plant Genetic Systems）将苏云金芽孢杆菌的Bt 毒素基因引入烟草植株中，使烟草获得合成保护素的能力，我国也批准了几十项转基因抗虫植物进入大田释放。