PCR实验-引物设计：简单有效，专业合成

了解了PCR实验的具体步骤后，我们就能进入引物设计这一最重要的实验环节了。

我们要记得，引物是DNA聚合酶合成DNA的“依靠”，DNA聚合酶就是从引物的3’端开始添加脱氧核苷酸的，也就是说，PCR完成后，引物将是PCR产物的一部分。 所以我们首先考虑的是做PCR的目的，我们要用这个PCR产物做什么。 除了和模板序列两端互补的序列外，如果我们要用它来克隆一个基因或别的DNA片段，最好在引物序列中加上和载体质粒相匹配的限制性内切酶切点。 如果想利用同源重组把它插入一个基因组DNA，就要在引物序列里安装上与同源区两端互补的序列。 如果只是想利用PCR检验一个DNA序列是否存在，那么引物的设计就很简单，只要设计出和要检验的序列两端互补的序列就行。

在引物序列的设计中我们也必须决定一个适当的变性/复性温度（Tm）。 Tm是由DNA的链间氢键决定的。 我们在第三章说过，G和C之间有3个氢键，A和T之间有两个氢键。 因此，GC对的变性温度比AT对更高。 在设计引物的时候，可以用改变DNA的GC含量的方法来改变引物的Tm。 变性/复性温度过高，可能使复性不容易进行，降低PCR的扩增效率；过低虽然会增加复性概率，但同时会降低PCR的专一性，因而降低PCR产物的纯度，甚至得到一大堆乱七八糟的废品。 因此，在确定实验中的最适Tm时，要广泛查阅文献资料，了解别人的工作经验，作为自己工作的借鉴。 如果实在找不到相关的文献（这在创造性的科学研究中是常有的事），就要设计几个不同的Tm，进行试验性实验，比较结果，从中找出最适条件。 当然这样做要费事得多，要做许多次的克隆和DNA测序，但是必须这样做。 因为科学工作要求的是脚踏实地，不能有丝毫的懈怠和侥幸心理。

当然，现在在科学网站上已经有了一些引物设计程序，可以按照实验者的要求自动确定引物序列，这大大地减轻了研究者的劳动强度。 但是，我们仍然要十分小心，要有尽量多的把握，争取多成功几次，少失败几次。(www.xing528.com)

现在由于科学市场的不断发展，DNA引物的合成已经成为科研服务公司的专业工作。 科学家只要设计好引物序列，通过电子邮件发送到DNA合成公司，公司就会按照要求完成DNA合成，把高质量的引物用冷冻箱快速送到实验室。 科学家在做成功PCR的时候，不应忘记这里也有科研服务公司的一份贡献——当然，他们得到了相应的报酬。 因此，我们要注意的就是力争所合成的每一个引物都能各尽其用，不要有一个引物因PCR失败而被浪费，要知科研经费的申请绝不是容易的事！

再说点在引物设计中有“共性”的事。 引物的长度一般是十几个到三四十个核苷酸；它们的Tm一般在50～55℃（由实验目的决定，也有低至37℃或高至60℃的）；许多引物在5’端还有一段序列不和模板DNA配对，做其他用途的序列如限制性内切酶切点就安放在这段序列上。 这段序列在DNA复制反应中会变成PCR产物的双链的一部分（请读者想想为什么）。 引物序列中不能有自身配对，理由就不用笔者说了。 最后，不要忘记，引物一定是成双成对的，一个是5’端引物，一个是3’端引物，它们一个从模板DNA（叫“正链”）3’端开始合成模板的互补链，另一个从新合成的模板互补链的3’端开始合成新的正链。