代谢工程：理论、技术与途径

一、代谢工程的理论技术

1.基本概念

代谢工程是由美国化学工程专家Bailey和Stephanopoulos等分别于1991年在《Science》上著文首先提出的。Bailey所论述的代谢工程的定义：“用重组DNA技术操纵细胞酶、运输和调节功能来改进细胞活性，亦即利用重组技术对细胞酶促反应、物质运输以及调控功能进行遗传操作，进而改良细胞生物活性的过程。”随之，这项工作得到很快推进。1998年国际上第一部代谢工程教科书《Metabolic Engineering—Principles and Methodologies》由Stephanopoulos等人出版。该书认为“代谢工程的一个基本目标就是阐明代谢能量（metabolic fluxes）控制的因素和机制，并为特定的产物的生物合成提供可选择的途径。”这都表达了代谢工程与细胞内在生理生化网络系统的高度结合。

国内代谢工程研究始于20世纪90年代，张蓓编写的《代谢工程》（2003）也表达了国内外代谢工程的开展，本节在此作了引用。值得提及，我们认为在代谢工程上“metabolic flux（es）”作为关键字组使用上应译为“代谢流量”为合适。赵学明在Stephanopoulos的《代谢工程》一书中译为代谢通量，这是物理学中常用的词，但张蓓在所写的书中却用了“代谢流”一词。两者应该得到统一，否则误认为是两种概念。当然，这个词在不同情况下可以有不同的用法。

呼吸代谢和代谢的调节在现代生理学和生物化学领域中研究是很成功的。但传统的生化代谢的调节只是在生命自然发生基础上调节而不是从根本改变遗传特性。由此认为，代谢工程则是基因工程发展产物。所以，代谢工程就是应用重组DNA技术和应用分析生物学相关的遗传学手段进行精确目标的基因操作，以改变微生物原有的调节系统，有目的地将细胞代谢活性提到这一预期目标的一个崭新科学领域。

2.基本内容

代谢工程与传统的诱变育种技术不同，也与生化因子调节代谢途径的作用不同，它是一种以进行代谢改造或代谢网络重构为目的，涉及生理学、分子生物学、生物化学及生物途径工程学等多门学科的实际应用。一般来讲，代谢工程学涉及的主要内容有以下几方面：①生物合成相关代谢调控和代谢网络理论；②代谢流（物质与能量流）的定量分析，代谢网络的设计与构建；③中心代谢作用机理及相关代谢分析；④基因操作。

代谢网络理论是把细胞的生化反应以网络整体而不是孤立地考虑。“网络”一词借用于信息网络概念，实为途径系统的复合体，故代谢工程亦有途径工程之称。细胞代谢的网络由成千上万种酶催化的系列反应系统、膜传递系统、信号传递系统组成，彼此联系与相互调节。

一般将代谢网络分流处的代谢产物称为节点，其中对终止产物起决定作用的少数节点称主节点；节点又分为柔性、强刚性和弱刚性三类。所谓柔性节点，是指由节点流向各分支的代谢流量分割率随代谢要求发生相应的变化，去除产物的反馈抑制后，该分支的代谢流量分割率大大增加。强刚性节点是指由节点流向某一分支或某些分支的代谢流量分割率是难以改变的，这是由产物的反馈抑制及对另一分支酶的反式激活的相互作用所致。弱刚性节点是介于两者之间，由该节点流向各分支的代谢流中有一个是占主导地位的，其酶活性较高或对节点代谢的亲和力较大，且无反馈抑制，通过削弱主导分支的酶量或酶活性可增加产物的产率。一般地，柔性及弱刚性节点是代谢设计的主要对象，而节点的刚性程度必须在代谢改造策略制订之前进行分析判断。

代谢分析是代谢工程的重要组成部分。它涉及代谢流的定量和定向，包括基于模型动力学、控制理论、示踪实验、磁化转移、代谢平衡的流量评价理论及通过环境改变细胞组成等控制的代谢流定向；同时还要研究细胞内代谢浓度的反应工程方向以及细胞内稳定流分析所运用的相关复杂技术。所以说，代谢流量是细胞生理学的最基本的度量，与胞内代谢物浓度一起，为解释代谢流量控制的复杂机理提供了必需的信息。

代谢流分析是代谢分析的一个重要手段，研究工作很多，都在探讨之中。例如，Jorgenson（1995）应用代谢流量分析丝状真菌黄青霉（Pernicillum chrysorgenum）生产青霉素，未计算流加连续培养期间的代谢流量的分布，同时还计算了导向半胱氨酸的不同生物合成途径（半胱氨酸是青霉素生物合成的前体）的最大理论得率。高红亮等（2000）应用代谢流平衡模型定量分析了杂交瘤细胞的代谢流量分布。在连续培养的杂交瘤细胞中，当葡萄糖和谷氨酰胺的流加浓度分别为13.8mmol/L和2.6mmol/L时，86.2％的葡萄糖通过糖酵解途径生成乳酸，7.5％生成脂类，进入TCA循环的仅占0.83％；谷氨酰胺中氮的3％用于核酸合成，54.4％生成氨，另有38.2％生成氨基酸，其中有34.1％碳架进入TCA循环。另外，利用放射标记技术，使代谢流分析较为简单方便。

3.基本手段(www.xing528.com)

（1）代谢设计

代谢工程研究对象是代谢途径，当然，代谢设计必须在代谢分析基础上进行。相对随机突变而言，代谢工程的一个显著特点就是工作具有定向性，因为它在修饰靶点选择、试验设计以及数据分析方面占有绝对优势。从自然界分离具有特殊性状的野生型微生物菌种以及利用传统诱变方法筛选遗传性状优良菌种，则是代谢设计和靶点选择的重要信息资源和理论依据。这个过程称之为“逆代谢过程”，先有结果，后分析原因。虽然单纯为了获取一个理想代谢途径而采取传统的诱变盲种方法并不是最佳选择，但这种操作积累的信息却具有重大的使用价值。

然而，正确的靶点设计还必须对现有的代谢途径和代谢网络信息进行更深入的分析。即便是基因操作也离不开基础代谢途径的运行。首先，根据化学动力学和计量学原理测定代谢网络中的代谢流分布，其中最重要的是细胞内碳和氮元素的流向比例关系；与此同时，在代谢流分析的基础上调查其控制状态、机制和影响因素。最后，根据代谢流分布和控制的分析结果才确定代谢设计和合理靶点，包括拟修饰基因的靶点、拟导入途径的靶点或者拟阻断途径的靶点等。应该说，代谢分析与代谢设计是代谢工程实施的关键，任何精细的靶点选择都必须经得起细胞生理特性以及代谢网络热力学平衡检验。

（2）检测技术与分析技术

常规的理化和生化检查手段都可用于代谢工程的研究。如用生化的酶学反应动力学、同位素示踪代谢流的富集与平衡以及光谱学等方法分析相关化合物和相对分子质量的分布，还有生物传感器技术在器官和酶水平上的应用能测得内酶促反应状态和底物与产物的含量。根据这些检测信息可以判断和描述代谢流的基本状态，并为细胞的代谢流及其控制分析提供可靠的原始数据。

上述检测到的技术数据，还需采用化学计量学、分子反应动力学和化学工程学的研究方法并结合先进的计算机技术，可以进一步阐明细胞代谢网络的动态特征与控制机理，以确定代谢改造思路。例如，A.Seressiotis等（1986）提出的MPS（代谢途径合成）体系可系统地构建生化途径，从而推测出产物的可能途径。随之，人们开始利用计算辅助设计生化途径，将计算出的理论转化率与代谢途径中诸多因素相结合，并在限定条件下模拟出从底物到产物的可能途径。

（3）基因操作

在代谢工程中，代谢网络的操作实质上就是基因水平上的操作。这个过程几乎涉及分子遗传学所有实验技术，如基因和基因簇的克隆、表达、调控，DNA的杂交检测与序列分析，外源DNA的转化，基因的体内同源重组与删除以及整合型重组DNA在细胞内的稳定态等。

在代谢工程的一些应用实例中，代谢流的控制和分析也可绕过基因操作，直接通过发酵和细胞培养的工艺和过程参数控制提高细胞代谢流，并强制使代谢流流向期望的目标产物。在此过程中，改变反应体系内的溶氧、pH、温度、流加补料等因素，在酶或相关蛋白因子水平上激活目的基因的转录和调节酶的活性，进而达到改变和控制细胞代谢流的目的。这种非基因水平的工艺优化操作与典型的基因操作在效果上也许没有显著的差异，但在新产物的合成尤其是遗传性状的改良等方面，基因操作是不可代替的。因为只有引入外源的基因或基因簇，才能从根本上改造细胞的代谢途径，甚至重新构建新的代谢支路。

近几年代谢工程虽已取得一些进展，但要看到代谢途径的复杂性给检测分析带来不少麻烦，在某种程度上阻碍了它的应用。如今采用逆代谢工程办法，从限制生物活性的主要因素入手，鉴别所希望的表现型，并确定该表现型的决定基因，然后利用基因重组技术将目的基因克隆到宿主菌中，使之表达。这虽避开了复杂的代谢网络进行基因改造，但逆代谢工程研究的关键是如何确定负责相关表现型的基因。然而，人们在微生物和细胞培养中所积累的遗传表型反应数据和标准微生物系统遗传、生理和生物化学特性方面的背景资料，加上自动化的现代分析工具，使得基因和表现型之间的相关分析成为可能。