免疫传感器的不同类型及应用领域

根据换能器的类型不同,免疫传感器主要分为电化学免疫传感器、光学免疫传感器、微重量免疫传感器。根据操作方式的不同,免疫传感器还可以分为直接型免疫传感器和非直接型免疫传感器。直接型免疫传感器是指在没有外加标记物时,换能器能直接测量免疫复合物于界面形成时的物理效应或化学效应。非直接型免疫传感器在检测过程中通常会使用一种或多种标记物,换能器通过间接检测标记物的信号来检测被分析物质。非直接型免疫传感器需多次洗涤及分离的步骤,有时也被称为免疫分析。相对于直接型免疫传感器,非直接型免疫传感器具有灵敏度高、耐干扰性强等优点。图5.7是直接型免疫传感器和非直接型免疫传感器的一般工作原理。

图5.7　直接型免疫传感器和非直接免疫传感器的工作原理

1.电化学免疫传感器

电化学免疫传感器由于具有高灵敏度、低成本和灵活便携等优点,成为免疫传感器中研究最早、种类最多的一个分支,也是较为成熟的一个分支。电化学免疫传感器的基本工作原理是采用电化学检测方法检测标记物的免疫试剂或者一些酶、金属离子和其他电活性物质标记的标记物,从而对疾病诊断或者患者状态监测中复杂体系的多组分混合物分析提供数据。用于电化学免疫传感器检测中的换能器主要分为电位型、电流型、电容型及电导型四大类。

(1)电位型免疫传感器直接或间接用在检测各种抗原、抗体方面,具有响应时间短、可实时检测等特点,主要分为直接型电位型免疫传感器和酶标记电位型免疫传感器。直接型电位免疫传感器利用抗原或抗体在水溶液中两性解离本身带电的特性,若将其中一种固定在电极表面或膜上,当另一种与之结合形成抗原抗体复合物时,原有的膜电荷密度将发生改变,从而引起膜的电位和离子迁移的变化,最终导致膜电位改变。酶标记电位型免疫传感器将免疫化学的专一性和酶化学的灵敏性融为一体,用于对低含量物质的检测,主要用到的标记酶有辣根过氧化物酶(HRP)、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶和脲酶。

电位型免疫传感器存在的主要问题是非特异性吸附和背景干扰。一般来说,生物分子的电荷密度相对于溶液背景来说比较低,这使得电位型免疫传感器的信噪比一般都较低,同时,生物样品中干扰组分在电极表面的非特异吸附会带来干扰,影响了测定的可靠性,这些缺陷成为电位型免疫传感器应用于实际的障碍。

(2)电流型免疫传感器的主要原理有竞争法和夹心法两类。竞争法是用酶标抗原与样品中的抗原竞争结合电极上的抗体,催化氧化还原反应,产生的电活性物质会引起电流变化,从而可测得样品中抗原浓度。夹心法是在样品中的抗原与电极上的抗体结合后,再将酶标抗体与样品中的抗原结合,形成夹心结构,从而催化氧化还原反应,产生电流值变化。第一代酶标记电流型免疫传感器以非电活性物质(如O2等)作为氧化还原的电子受体为代表。先用竞争法或夹心法将葡萄糖氧化酶或过氧化物酶标记物结合到膜或电极上,再通过氧电极测量葡萄糖转化为葡萄糖酸过程中消耗的氧,或过氧化氢分解过程中产生的氧。

(3)物质在电极表面的吸附以及电极表面电荷的改变都会对双电层电容产生影响,电容型免疫传感器正是建立在这一理论基础上的。当弱极性的物质吸附到电极表面上时,双电层厚度增大,介电常数减少,从而使得双电层电容降低。蛋白质作为一类弱极性的生物大分子,吸附到电极表面后会明显地降低电极表面双电层电容。目前研究正处于起步阶段,由于其具有制作简单、无须任何标记、灵敏度很高、检测限低等突出的优点,引起了人们的广泛关注,近年来得到很快的发展。

(4)电导型免疫传感器是通过测量免疫反应引起的溶液或薄膜的电导变化来进行分析的生物量传感器。电导型免疫传感器使用酶作为标记物,酶催化其底物发生反应,导致离子种类或离子浓度发生变化,从而使得溶液导电率发生改变。这种免疫传感器构造简单、使用方便,但是这类传感器受待测样品离子强度以及缓冲液容积的影响很大,另外,在这类传感器的应用中非特异性问题也很难得到有效解决,因此电导型免疫传感器发展比较缓慢。

2.光学免疫传感器

几乎所有的光学现象(发光、荧光、散射、折射等)都可以用来研究生物量化学传感器,与传统的免疫检测方法相比,光学免疫传感器被认为是临床诊断和环境分析的一种有效的方法,近年来由于光学传感技术的迅速发展,光学技术在免疫传感器上应用的比重在逐年上升。光学免疫传感器可以分为两类:直接型光学免疫传感器和基于分子信号标记的间接性免疫传感器。

目前商品化程度最高的是表面等离子体共振(SPR)免疫传感器(如图5.8所示)。SPR 是一种物理光学现象,SPR 检测是利用表面等离子体波进行检测的一项技术,当样品与芯片表面的生物分子识别膜相互作用时,会引起金膜表面折射率的变化,这将导致SPR 角度变化,通过检测SPR 角的变化,可以获得被分析物的浓度、亲和力、动力学常数等信息。

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SPR免疫传感器

图5.8　SPR 免疫传感器示意图

与其他光学免疫传感器相比,SPR 生物传感器具有如下显著特点。

(1)能实时检测,并且能动态地监测生物分子相互作用的全过程。这是SPR 生物传感器独有的特点,是传统的检测方法所办不到的。

(2)无须标记样品,保持了分子活性。

(3)样品需要量极少。

(4)检测过程方便快捷,灵敏度高,其检测灵敏度可以与放射性元素标记技术媲美。

(5)应用范围非常广泛。

(6)能获得高通量、高质量的分析数据等。

另外,具有高灵敏度和高选择性的荧光光学检测技术与荧光标记物标记的免疫试剂相结合的荧光免疫传感器也得到了广泛应用。荧光标记的抗体或抗原结合到传感器表面,并进入光场中,入射光激发荧光分子,从而可以产生可测量的荧光信号。基于荧光增强或猝灭技术的光导纤维免疫传感系统在检测基于抗原-抗体反应的多种蛋白质时,具有免分离和无试剂加入的优点。

3.微重量免疫传感器

微重量免疫传感器结合了压电响应的高灵敏度和抗体-抗原反应的高特异性。其检测的基本原理:在吸附识别区发生的选择性结合会引起传感器表面质量和界面特性(黏弹性和表面硬度)的改变,这些改变可以通过振荡频率的位移来识别。该类传感器的突出特点是成本低、操作简单、灵敏度高和能够实时输出。微重量传感器有气相和液相两种传感模式,广为人知的是石英晶体微天平。