一、操作规程
（一）方法原理
采用酶联免疫法，用HIV-1/HIV-2特异性抗原包被微孔反应板，用HIV-1/HIV-2抗原标记辣根过氧化物酶，采用双抗原夹心法检测人血清、血浆样本中的HIV-1和HIV-2。
（二）检测样本类型
检测样本为人血清或血浆样本。
（三）仪器设备
酶标仪、洗板机、普通冰箱、水浴箱（或温箱）、离心机、移液器、微孔震荡器、生物安全柜、高压蒸气灭菌器等。
（四）试剂耗材
人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）、人类免疫缺陷病毒标准物质、带滤芯Tip头、带螺旋盖或后开盖的微量离心管、移液管、封片纸等。
（五）操作步骤
1.配制工作浓度洗涤液（以纯化水做25倍稀释，例：量取480mL纯化水，加入20mL洗涤液，充分混匀后，成500mL工作浓度洗涤液，待用）。根据试验要求，选择一定量的反应板条。
2.每次试验设抗-HIV-1阳性对照2孔（每孔100uL），抗-HIV-2阳性对照1孔（100uL），抗-HIV阴性对照1孔（100uL），采用人类免疫缺陷病毒标准物质作为外部质控1孔（10-30uL），建议预留空白对照1孔（不加样本和酶结合物，只加底物和终止液）。剩余各孔加待测样本100uL。
3.用封片纸覆盖反应板后，将反应板置37℃孵育60min。
4.取出反应板，撕去封片纸，洗涤反应板5次。手工洗板：弃去孔内液体，用步骤1配制的工作浓度洗涤液注满各孔，静置30～60s，甩干，重复5次后，在干净的吸水纸上拍干。洗板机洗板：选择洗涤5次程序，用步骤1配制的工作浓度洗涤液注满各孔，每次工作浓度洗涤液在反应板微孔中的停留时间为30～60s，并确保每次吸净无残留，洗完后在干净的吸水纸上拍干。
5.在已加入待测样本和阴性、阳性对照的孔中加入100uL酶结合物。混匀，用封片纸覆盖反应板，置37℃孵育30min。洗涤同步骤4。
6.洗涤结后立即在所有孔内加入显色剂A、显色剂B各50uL，混匀。
7.在微孔震荡器上震荡10s，或手工轻轻震荡10s。用封片纸覆盖反应板后，将反应板置37℃孵育30min。
8.在所有孔内加入50uL终止液，振荡反应板5s，使之充分混匀。
9.在酶标仪中，取波长450nm（建议使用双波长酶标仪比色，参考波长630nm或630nm相近的波长），若需扣除显色剂空白，则先用显色剂空白对照孔校零，然后读取各孔OD值。（加终止液后，务必在10min内读数）。
10.结果判读。
COV：Cut-Off Va1ue参考值。
NC：抗-HIV阴性对照OD值。
PCx：抗-HIV-1阳性对照平均OD值。
PC1，CP2：抗-HIV阳性对照OD值。
计算PCx：PCx＝（PC1+PC2）÷2。
检测有效性：同时满足下列条件的试验是有效的。
BL＜0.040（双波长读数）或＜0.080（单波长读数）
NC＜0.080
PCx＞0.8，抗-HIV-2阳性对照OD值＞0.3。
双波长读数，显色剂空白≤0.040，单波长读数，显色剂空白≤0.080。
计算COV：COV＝PCx×10%（若PCx＞2.5按2.5计算）。
S：待测样本的OD值。
当S≥COV时，说明该检测样本抗-HIV反应呈阳性。
当S＜COV时，说明该检测样本抗-HIV反应呈阴性。
阳性者须取样双孔复测，复测阳性者应按照全国HIV管理规范送HIV确认实验室进行确认实验。
二、人员防护
（一）HIV的生物危害
人类免疫缺陷病毒（HIV）属第二类病原微生物，是高致病性病原微生物。
（二）HIV相关检测的生物安全级别
1.HIV抗体检测（包括筛查和确证实验）、抗原检测和相关的免疫学检测应在符合Ⅱ级生物安全实验室（BSL-2）要求的艾滋病检测实验室中进行。
2.HIV分离培养、浓缩、中和试验、细胞培养及研究工作及其他需要应用活病毒的研究工作，应在Ⅲ级生物安全实验室（BSL-3）中进行。
3.HIV核酸提取和检测均应在符合Ⅱ级生物安全实验室（BSL-2）要求的艾滋病检测实验室中进行。
4.HIV病毒株应保存在符合Ⅲ级生物安全实验室（BSL-3）要求的艾滋病实验室。HIV阳性样品，包括全血、血清、血浆和其他组织（液）、核酸提取物应保存在符合BSL-2要求的艾滋病实验室。
（三）人员要求
艾滋病初筛实验室至少由3名医技人员组成，其中具有中级卫生技术职称人员至少1名。负责筛查试验的技术人员需具有2年以上从事病毒性疾病血清学检测工作经验，接受过省级以上艾滋病检测技术培训，并获得培训证书。开展艾滋病检测工作的实验室要经过技术和条件验收，未经验收或验收不合格的实验室不得开展艾滋病检测工作。
（四）个人防护
医务人员预防艾滋病病毒感染的防护措施应当遵照标准预防原则，对所有患者的血液、体液及被血液、体液污染的物品均视为具有传染性的病源物质。医务人员接触病源物质时，应当采取以下防护措施：
1.医务人员进行有可能接触患者血液、体液的诊疗和护理操作时必须戴手套，操作完毕，脱去手套后立即洗手，必要时进行手消毒。
2.在诊疗、护理操作过程中，有可能发生血液、体液飞溅到医务人员的面部时，医务人员应当戴手套、具有防渗透性能的口罩、防护眼镜。有可能发生血液、体液大面积飞溅或者有可能污染医务人员的身体时，还应当穿戴具有防渗透性能的隔离衣或者围裙。工作完毕，先脱去手套，再脱去隔离衣或者围裙，用肥皂和流动水洗手。穿过的污染的隔离衣或者围裙应及时放入污物袋中，消毒后方可洗涤或废弃。
3.遇有手部皮肤有开放性伤口及其他不适于工作的情况，应暂停工作。皮肤的微小伤口、擦伤、皲裂等，应用防水敷料严密覆盖。医务人员手部皮肤发生破损，在进行有可能接触患者血液、体液的诊疗和护理操作时必须戴双层手套。
4.医务人员在进行侵袭性操作过程中，要保证充足的光线，并特别注意防止被针头、缝合针、刀片等锐器刺伤或者划伤。(www.xing528.com)
5.使用后的锐器应当直接放入耐刺、防渗漏的利器盒，或者利用针头处理设备进行安全处置，也可以使用具有安全性能的注射器、输液器等医用锐器，以防刺伤。
6.禁止将使用后的一次性针头重新套上针头套。禁止用手直接接触使用后的针头、刀片等锐器。
7.应为每一名在艾滋病实验室工作的人员提供充足的防护服、一次性乳胶手套、口罩、工作帽和鞋套等。应将清洁的防护服和其他个人防护用品置于实验室清洁区内的专用处存放。
8.实验室应设置应急冲洗眼睛装置。
9.工作人员上岗前必须进行HIV抗体和乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等肝炎病毒标志物检测，应接种乙肝疫苗。应每年对工作人员采血检测HIV抗体，血清应长期保留。
10.进实验室工作前要摘除首饰，修剪长的带刺的指甲，以免刺破手套。
11.操作过程中，如发现防护服被污染应立即更换，如手套破损，应立即丢弃、洗手并换上新手套。不能用戴手套的手触摸暴露的皮肤、口唇、眼睛、耳朵和头发等。不要将手套清洗或消毒后再次使用，因为使用表面活性剂清洗可使手套对水的通透性增加，消毒剂可以引起手套的破损。
12.应严格按要求妥善保存血清及其他体液样品，应按有关规定设立专门储存阳性血清、质控品的血清库和/或毒种库，应上锁并指定专人管理。对存放试剂和有毒有害物质的区域应进行监控，冷藏柜、冰箱、培养箱和存放生物试剂、化学危险品、放射性物质的容器，置于工作人员视线之外的地点时应上锁。
13.医务人员发生职业暴露后严格按照《医务人员艾滋病病毒职业暴露防护工作指导原则（试行） 》进行处理。
三、标本采集及处理
（一）采样前准备
采样前应检查所需物品是否已备齐，是否在有效期内，有无破损，是否足量，特别应检查受检者信息与样本容器表面的标记是否一致，并注明样本采集时间及唯一编码，保证每一份样本具有唯一性编码（编号）。采血前，先对试管或滤纸进行标记，核对后编码。要将标签贴在试管的侧面，推荐使用预先印制好的、专门用于冷冻储存的耐低温标签。
（二）样本的采集和处理
1.抗凝全血：消毒局部皮肤，用加有抗凝剂（EDTA 钠盐或钾盐、枸橼酸钠、肝素钠）的真空采血管抽取适量静脉血，或用一次性注射器抽取静脉血，转移至加有抗凝剂的试管中，轻轻颠倒混匀10～15次，备用。
2.末梢全血：消毒局部皮肤（成人和1岁以上儿童可选择耳垂、中指、无名指或食指，1岁以下儿童采用足跟部）。用采血针刺破皮肤，用无菌棉签擦掉第一滴血。收集滴出的血液，备用。
3.血浆：根据检测需要，选择含适宜抗凝剂的采血管，按照采血管说明采集静脉血，分离血浆。或将采集的抗凝全血1500～3000r/min离心15min，上层即为血浆，吸出置于合适的容器中，备用。
4.血清：根据检测需要，按照采血管说明采集静脉血，分离血清。或用不含抗凝剂的真空采血管抽取适量静脉血，或用一次性注射器抽取静脉血，转移至无抗凝剂或含促凝剂的试管中放置1～2h，待血液凝固、血块收缩后再用1500～3000r/min离心15min，吸出血清，置于合适的容器中，备用。
（三）样本采集后处理、保存、运输的时限和条件，因不同的检测项目而异，应参见相应检测项目要求
（四）采血完成后的穿刺针头必须丢弃于尖锐危险品容器内，妥善处理，防止发生职业暴露
（五）样本的保存
1.用于抗体和抗原检测的血清或血浆样本，短期（1周）内进行检测的可存放于 2～8℃，一周以上应存放于-20℃以下，3个月以上应置于-70℃以下保存。
2.筛查结果为阳性的样本应及时进行补充试验。筛查结果为阴性的样本，可根据具体需要决定保存时间，建议至少保存1个月。艾滋病检测确证实验室收到的筛查阳性样本，无论补充试验结果如何，均应保存剩余样本，保存时间根据需要确定，建议至少保存3年，特殊用途或专项项目的样本根据具体要求确定保存时间。补充试验结果为阳性的样本按照国家生物样本管理的有关规定执行。
（六）样本的运送
1.全血、血浆的运送应符合生物安全要求，参照《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》（卫生部第45号令，2006年2月1日执行）。
2.血液样本运送时应采用三层容器对样本进行包装，随样本应附有与样本唯一性编码相对应的送检单。送检单应标明受检者姓名、样本种类等信息，并应放置在第二层和第三层容器之间。
（1）第一层容器：直接装样本，应防渗漏。样本应置于带盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样本的唯一性编码或受检者姓名、种类和采集时间。在试管的周围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。
（2）第二层容器：容纳并保护第一层容器，可以装若干个第一层容器。要求不易破碎、带盖、防渗漏、容器的材料要易于消毒处理。
（3）第三层容器：容纳并保护第二层容器的运输用外层包装箱。外面要贴上醒目的标签，注明数量、收样和发件人及联系方式，同时要注明“小心轻放、防止日晒、小心水浸、防止重压、禁止倒立”等字样，还应易于消毒。
（4）用于抗体检测的血清和血浆样本应在冻存条件下运送。
（5）运送样本必须有记录。
（七）样本的接收
1.样本包裹必须在具有处理感染性材料条件的实验室内、由经过培训的工作人员打开，打开包裹时应穿戴防护衣、戴手套、口罩和防护眼镜，在生物安全柜中打开，用后的包裹应及时进行消毒。
2.核对样本与送检单，检查样本管有无破损和溢漏。如发现溢漏应立即将尚存留的样本移出，消毒样本管和盛器，同时报告实验室负责人和上一级实验室技术人员。
3.检查样本的状况，记录血液样本有无严重溶血、微生物污染、血脂过多以及黄疸等情况。记录尿液样本包装是否完整，如果污染过重或者不符合接收要求，应将样本安全废弃。并立即将样本情况通知送样人，要求重新采集样本。
4.接收样本时应填写样本接收单。
四、实验室消毒
（一）物理消毒方法
1.高压蒸汽消毒，121℃，保持15～20min。
2.干燥空气烘箱消毒（干烤消毒），140℃，保持2～3h。
（二）化学消毒方法
1.含氯消毒剂（次氯酸钠，含有效氯2000～5000mg/L）。
2.75%酒精。
3.2%戊二醛。
（三）艾滋病检测实验室物品常用的消毒方法
1.废弃物缸：5000mg/L 次氯酸钠。
2.生物安全柜工作台面和仪器表面：75%酒精。3.溢出物：5000mg/L次氯酸钠。
4.污染的台面和器具：2000mg/L次氯酸钠，也可以用过氧化氢或过氧乙酸。器械可用2%戊二醛消毒。
五、废弃物处置
1.应按照《实验室生物安全通用要求》（GB 19489—2008）和《消毒技术规范》（2002年版）处置实验室废弃物。
2.艾滋病实验室产生的所有废弃物，包括不再需要的样品、培养物和其他物品，均应视为感染性废弃物，应置于专用的密封防漏容器中，安全运至消毒室，经高压消毒后再进行处理或废弃。
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