传染病医院感染防控操作手册

一、操作规程

（一）新冠病毒核酸的荧光定量RT-PCR检测

1.方法原理：采用实时荧光PCR技术，以新型冠状病毒2019-nCoV的ORF1ab和N基因设计特异性引物和TaqMan探针，通过荧光定量PCR仪进行扩增，从而实现对新型冠状病毒2019-nCoV核酸的检测。临床样本核酸提取后，进行一步法RT-PCR扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线。建议采用带有内参对照的试剂盒，用于对样本采集、保存和运输以及核酸提取过程进行监控，避免假阴性结果的误判。

2.检测样本类型：检测样本为咽拭子、痰液等。

3.仪器设备：荧光定量PCR仪、核酸提取仪、生物安全柜、离心机、涡漩震荡混合器、移液器、高压蒸气灭菌器等。

4.试剂耗材：新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒、核酸提取试剂盒、带滤芯Tip头、带螺旋盖或后开盖的微量离心管、移液器和PCR专用反应管、反应板及相应的荧光定量PCR专用反应盖、封板膜等。

5.操作步骤：

（1）试剂准备。应当选择国家药品监督管理部门批准的试剂，建议选择磁珠法、膜吸附法等进行核酸提取，建议根据核酸提取试剂及扩增体系的要求选择配套的标本采样管，不建议免提取核酸直接进行核酸扩增反应。

（2）标本处理。使用含胍盐等灭活型采样液的标本无须进行灭活处理，可直接进行核酸提取，而使用非灭活型采样液的标本，按照核酸提取试剂盒的说明，取适量标本加至核酸提取裂解液中充分混匀作用一定的时间则可以有效灭活病毒。在不满足以上灭活条件下，可采用56℃孵育30min的处理方式灭活病毒。污水样本处理可参考《农贸（集贸）市场新型冠状病毒环境监测技术规范》（WS/T 776—2021）推荐的方法。

（3）核酸提取。将灭活后的标本取出，在生物安全柜内打开标本采集管加样。或按照核酸提取试剂盒的说明，将标本与裂解液作用足够时间后继续核酸提取步骤，核酸提取完成后立即封盖。按要求取核酸提取产物加至PCR 扩增反应体系中。

（4）核酸扩增。将扩增体系放入荧光定量PCR仪，按照试剂盒说明书设置扩增程序，启动扩增程序。扩增完成后反应管不可开盖，直接放于垃圾袋中，封好袋口，不可高压，按一般医疗废物转移出实验室处理。

核酸检测方法主要针对新冠病毒基因组中开放读码框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核壳蛋白（nuc1eocapsid protein，N）。

靶标一（ORF1ab）：

正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA

反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA

荧光探针（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'

靶标二（N）：

正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT

反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG

荧光探针（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'

（5）结果判断。

阴性：无Ct值无“S”形扩增曲线。

阳性：Ct值小于等于检出限，且有“S”形扩增曲线，可报告为阳性。

灰区：Ct值位于灰区，建议重复实验，若重做Ct值仍处于灰区，但出现明显的“S”形扩增曲线，该样本判断为阳性，否则为阴性。

注：如使用商品化试剂盒，则以厂家提供的说明书为准。

（6）病例确认。

实验室确认阳性病例需满足以下两个条件中的一个：

条件一：同一份标本中新冠病毒2个靶标（ORF1ab、N）实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性。如果出现单个靶标阳性的检测结果，则需要重新采样，重新检测。

条件二：两种标本实时荧光RT-PCR同时出现单靶标阳性，或同种类型标本2次采样检测中均出现单个靶标阳性的检测结果，可判定为阳性。

环境与生物材料核酸检测阳性要排除疫苗接种物残留污染的影响。核酸检测结果假阴性的可能原因包括：样本质量差。样本采集时间过早或过晚。样本保存、运输和处理不当。其他原因如病毒变异、PCR抑制等。

（7）质控。

①性能验证。临床标本检测前，实验室应对核酸提取试剂、提取仪、扩增试剂、扩增仪等组成的检测系统进行必要的性能验证，性能指标包括但不限于精密度（至少要有重复性）和最低检测限。建议选用高灵敏的试剂（检测限≤500拷贝/mL）。

②室内质控。实验室可按照《国家卫生健康委办公厅关于医疗机构开展新型冠状病毒核酸检测有关要求的通知》（国卫办医函〔2020〕53号）要求规范开展室内质控。每批检测至少有1份弱阳性质控品（第三方质控品，通常为检出限的1.5～3倍）、3份阴性质控品（生理盐水）。质控品随机放在临床标本中，参与从提取到扩增的全过程。大规模人群筛查时，一旦出现阳性结果，应对阳性标本采用另外一到两种更为灵敏的核酸检测试剂对原始标本进行复核检测，复核阳性方可报出。物品和环境样本的采集检测，还需在采样前及采样过程中至少设一个现场空白样本及一个运输空白样本，以进行过程中的质量控制。

③室间质评。实验室应常态化参加国家级或省级疾控机构组织的室间质评。对检测量大以及承担重点人群筛查等任务的实验室，可适当增加室间质评频率。

（二）血清抗体检测

血清抗体检测（胶体金、磁微粒化学发光、ELISA）用作新冠病毒核酸检测阴性病例的补充检测，在疑似病例诊断中与核酸检测协同使用。建议采集急性期（发病7天内）和恢复期（3～4周后）双份血清进行检测，也可根据临床需要确定采集时间。抗体检测阳性者应排除新冠疫苗接种因素的影响。

二、人员防护

（一）实验活动规范

根据新冠病毒传播特性、致病性和临床资料等信息，该病毒按照第二类病原微生物进行管理，具体要求如下：新冠病毒培养、动物感染实验应当在生物安全三级及以上实验室开展。未经培养的感染性材料的操作应当在生物安全二级及以上实验室进行，同时采用不低于生物安全三级实验室的个人防护。灭活材料的操作应当在生物安全二级及以上实验室进行。不涉及感染性材料的操作，可以在生物安全一级实验室进行。

（二）核酸检测实验室设置要求

新冠核酸检测实验室按功能区布置位置的不同，可分为集中布置形式和分散布置形式。开展新冠病毒核酸检测的实验室应当设置以下区域：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增和产物分析区。根据所采用仪器的实际情况，标本制备区、扩增和产物分析区可进行合并。集中布置形式的实验室设置应遵循“各区独立，单向流动（注意风向，压力梯度走向），因地制宜，方便工作”的原则。各区都应该按照《医疗机构消毒技术规范》的标准要求配置足够强度的悬挂式紫外灯或移动式紫外消毒车。

各区的功能如下：

（1）试剂储存和准备区：用于分装、储存试剂、制备扩增反应混合液，以及储存和准备实验耗材。该区应配备冰箱或冰柜、离心机、试验台、涡旋振荡器、微量加样器等。为防止污染，该区宜保持正压状态。

（2）标本制备区：标本转运桶的开启、标本灭活（必要时）、核酸提取及模板加入至扩增反应管等。该区应配备冰箱或冰柜、生物安全柜、离心机、试验台、微量加样器，可根据实际工作需要选配自动化核酸提取仪等。标本转运桶的开启、分装应在生物安全柜内完成。为防止污染，该区宜保持负压状态。为操作方便，标本的分装以及核酸提取也可以在独立的生物安全二级（BSL-2）实验室进行，提取的核酸可以转运至该区加至扩增反应液中。

（3）核酸扩增和产物分析区：进行核酸扩增反应和产物分析。该区应配备实时荧光定量PCR仪。为防止扩增产物污染环境，该区宜保持负压状态，压力等于或低于标本制备区。

（三）检测人员要求

实验室检测技术人员应当具备实验室工作经历以及相关专业技术技能，接受过新冠病毒相关检验检测技能培训。检测机构应当按照所开展检测项目及标本量配备实验室检测人员，以保证及时、高效完成检测和结果报告。

（四）个人防护

N95口罩、双层乳胶手套、面屏、护目镜、防护服、防水围裙或防水隔离衣、工作帽。一线工作人员采取生物安全二级防护，标本采集、实验室检测、病例救治、隔离点管理等人员采取生物安全三级防护基础上加穿防水围裙或隔离衣。

三、标本采集及处理

（一）采集对象

新冠肺炎病例、可疑感染人员和其他需要进行检测的人员，以及可能被污染的环境或物品等。

（二）采样人员基本要求

从事标本采集的技术人员应当经过生物安全、检测技术培训并合格，熟悉标本采集方法，熟练掌握标本采集操作流程。应严格按照操作流程进行采样，按要求做好标本信息记录，确保标本质量符合要求、标本及相关信息可追溯。

（三）采集标本种类

每个病例必须采集急性期呼吸道标本（包括上呼吸道标本或下呼吸道标本），重症病例优先采集下呼吸道标本。根据临床需要可留取便标本、全血标本、血清标本和尿标本。物品和环境标本根据监测需求采集。

标本种类：

（1）上呼吸道标本：包括鼻咽拭子、咽拭子等。

（2）下呼吸道标本：深咳痰液、肺泡灌洗液、支气管灌洗液、呼吸道吸取物等。

（3）便标本/肛拭子：留取粪便标本约10g（花生大小），如果不便于留取便标本，可采集肛拭子。

（4）血液标本：抗凝血，采集量5mL，建议使用含有EDTA抗凝剂的真空血管采集血液。

（5）血清标本：尽量采集急性期、恢复期双份血清。第一份血清应当尽早（最好在发病后7天内）采集，第二份血清应当在发病后第3～4周采集。采集量5mL，建议使用无抗凝剂的真空采血管。血清标本主要用于抗体的测定，不进行核酸检测。

（6）尿标本：留取中段晨尿，采集量2～3mL。(www.xing528.com)

（7）物体表面标本：包括进口冷链食品或进口货物的内外包装表面，以及运输储藏工具等可能被污染的部位进行涂抹采集的标本。

（8）污水标本：根据海运口岸大型进口冷冻物品加工处理场所排水系统分布情况，重点选取污水排水口、内部管网汇集处、污水流向的下游或与市政管网的连接处等2～3处点位进行采样。

（四）标本采集和处理

1.鼻咽拭子：采样人员一手轻扶被采集人员的头部，一手执拭子，拭子贴鼻孔进入，沿下鼻道的底部向后缓缓深入，由于鼻道呈弧形，不可用力过猛，以免发生外伤出血。待拭子顶端到达鼻咽腔后壁时，轻轻旋转一周（如遇反射性咳嗽，应停留片刻），然后缓缓取出拭子，将拭子头浸入含2～3mL病毒保存液（也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液）的管中，尾部弃去，旋紧管盖。

2.咽拭子：被采集人员先用生理盐水漱口，采样人员将拭子放入无菌生理盐水中湿润（禁止将拭子放入病毒保存液中，避免抗生素引起过敏），被采集人员头部微仰，嘴张大，并发“啊”音，露出两侧扁桃体，将拭子越过舌根，在被采集者两侧扁桃体稍微用力来回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次，将拭子头浸入含2～3mL病毒保存液（也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液）的管中，尾部弃去，旋紧管盖。咽拭子也可与鼻咽拭子放置于同一管中。

3.鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取黏液或从气管抽取呼吸道分泌物。将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出，收集抽取的黏液，并用3mL采样液冲洗收集器1次（亦可用小儿导尿管接在50mL注射器上来替代收集器）。

4.深咳痰液：要求患者深咳后，将咳出的痰液收集于含3mL采样液的采样管中。如果痰液未收集于采样液中，可在检测前，加入2～3mL采样液，或加入痰液等体积的痰液消化液。痰液消化液储存液配方见表4-1。

表4-1　痰液消化液储存液配方

使用时将储存液用去离子水稀释至50mL，与痰液等体积混合使用，或者参照试剂说明进行使用，也可采用痰液等体积的含1g/L蛋白酶K的磷酸盐缓冲液将痰液化。

5.支气管灌洗液：将收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气管（约30cm深处），注入5mL生理盐水，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出，收集抽取的黏液，并用采样液冲洗收集器1次，也可用小儿导尿管接在50mL注射器上来替代收集。

6.肺泡灌洗液：局部麻醉后将纤维支气管镜通过口或鼻经过咽部插入右肺中叶或左肺舌段的支气管，将其顶端契入支气管分支开口，经气管活检孔缓缓加入灭菌生理盐水，每次30～50mL，总量100～250mL，不应超过300mL。

7.粪便标本：取1mL标本处理液，挑取黄豆粒大小的便标本加至管中，轻轻吹吸3～5次，室温静置10min，以8000rpm离心5min，吸取上清液进行检测。粪便标本处理液可自行配制，配方见表4-2。

表4-2　粪便标本处理液配方

也可使用HANK’S液或其他等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液溶解便标本制备便悬液。如患者出现腹泻症状，则留取粪便标本3～5mL，轻轻吹打混匀后，以8000rpm离心5min，吸取上清液备用。

8.肛拭子：用消毒棉拭子轻轻插入肛门3～5cm，再轻轻旋转拔出，立即放入含有3～5mL病毒保存液的15mL外螺旋盖采样管中，弃去尾部，旋紧管盖。

9.血液标本：建议使用含有EDTA抗凝剂的真空采血管采集血液标本5mL，根据所选用核酸提取试剂的类型确定以全血或血浆进行核酸提取。如需分离血浆，将全血1500～2000rpm离心10min，收集上清液于无菌螺旋口塑料管中。

10.血清标本：用真空负压采血管采集血液标本5mL，室温静置30min，1500～2000rpm离心10min，收集血清于无菌螺旋口塑料管中。

11.物体表面标本：参考《农贸（集贸）市场新型冠状病毒环境监测技术规范》（WS/T 776—2021）推荐的方法，采样拭子充分浸润病毒保存液后在表面重复涂抹，将拭子放回采样管浸润，取出后再次涂抹采样，重复3次以上。对表面较大的物体进行多点分布式采样。

12.污水标本：参考《农贸（集贸）市场新型冠状病毒环境监测技术规范》（WS/T 776—2021）推荐的方法，采集污水的拭子样本时，用拭子浸入吸附污水，将拭子放回采样管浸润，取出后再次浸入污水，重复3次以上，对每个污水采样位置应进行多点分布式采样。采集污水的水体样本时，用聚乙烯塑料瓶收集1～1.5L污水，大于1.5L体积的污水采集，可以使用聚乙烯塑料桶或现场水样专用富集设备。污水水体样本采集前，先充分混合均匀后取样。如果污水难以充分混合，出现分层现象时，可按各层水量的比例分层取样。

13.其他材料：依据设计需求规范采集。

（五）标本包装

标本采集后在生物安全二级实验室生物安全柜内分装。

1.所有标本应当放在大小适合的带螺旋盖内有垫圈、耐冷冻的样本采集管里，拧紧。容器外注明样本编号、种类、姓名及采样日期。

2.将密闭后的标本装入密封袋，每袋限一份标本。样本包装要求要符合《危险品航空安全运输技术细则》相应的标准。

3.涉及外部标本运输的，应根据标本类型，按照A类或B类感染性物质进行三层包装。

（六）标本保存

用于病毒分离和核酸检测的标本应当尽快进行检测，可在24h内检测的标本可置于4℃保存。24h内无法检测的标本则应置于-70℃或以下保存（如无-70℃保存条件，则于-20℃冰箱暂存）。血清标本可在4℃存放3天，-20℃以下可长期保存。应当设立专库或专柜单独保存标本。

（七）标本送检

标本采集后应当尽快送往实验室，标本采集后室温（25℃）放置不宜超过4h。如果需要长途运输，建议采用干冰等制冷方式进行保藏。标本运送期间应当避免反复冻融。

1.上送标本：各省（自治区、直辖市）发现的本土疫情中的首发或早期病例、与早期病例有流行病学关联的关键病例、感染来源不明的本土病例、境外输入病例、入境物品及相关环境阳性标本等所有原始标本应平行采集至少2份，一份送各省级疾控机构进行检测，另一份上送中国疾控中心进行检测、复核，同时附样本送检单。各省分离到的新的代表性毒株，应及时送中国疾控中心复核、保藏。

2.标本及毒株运输。

（1）国内运输：新冠病毒毒株或其他潜在感染性生物材料的运输包装分类属于A类，对应的联合国编号为UN2814，包装符合国际民航组织文件Doc 9284《危险品航空安全运输技术细则》的PI620分类包装要求。环境样本属于B类，对应的联合国编号为UN3373，包装符合国际民航组织文件Doc 9284《危险品航空安全运输技术细则》的PI650分类包装要求。通过其他交通工具运输的可参照以上标准包装。新冠病毒毒株或其他潜在感染性材料运输应按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》（原卫生部令第45号）办理《准运证书》。

（2）国际运输：在国际间运输的新冠病毒标本或毒株，应当规范包装，按照《出入境特殊物品卫生检疫管理规定》办理相关手续，并满足相关国家和国际相关要求。

（3）标本和毒株的接收及管理：通过航空进行运送的标本抵达目的地机场后，由专业运输车辆运送至接收单位，通过陆路运输的标本由专业车辆进行运送，运送人员和接收人员应对标本进行双签收。新冠病毒标本及毒株应由专人管理，准确记录标本及毒株的来源、种类、数量，编号登记，采取有效措施确保毒株和样本的安全，严防发生误用、恶意使用、被盗、被抢、丢失、泄露等事件。

四、实验室消毒

（一）临床基因扩增检验实验室污染消毒处理

1.基本原则：立即停止工作，应按要求立即撤出相关人员，关闭污染房间门。上报应急指挥小组组长，污染间未经处理前，任何人不得进入。

2.清洁消毒方向：由清洁区向污染区进行，洁具不可交叉。准备区→标本制备区→扩增区→产物检测区。

3.清洁消毒范围：工作区域的物体表面（含桌、椅），可使用含氯消毒剂擦拭或75%酒精喷洒消毒，空气和工作台面可使用紫外线照射消毒，也可使用空间消毒器进行全环节消毒。

4.不可使用紫外线消毒器及化学消毒进行有人状态下的消毒。PCR室内的消毒应防止扬尘（减少人员走动）、杀灭DNA或RNA的基因片段。可选择悬挂紫外线灯管进行空气消毒，试验前照射30～60min，实验结束照射30～60min，必要时延长照射时间。

5.终末消毒：当出现实验室污染时，应按要求立即撤出相关人员，在无人情况下可使用化学消毒剂进行终末消毒，如熏蒸法：过氧乙酸1g/m3加热熏蒸（湿度70%～90%），密闭24h。气溶胶喷雾：3%过氧化氢20mL/m3气溶胶喷雾；5%过氧乙酸2.5mL/m3气溶胶喷雾（湿度20%～40%）。

（二）实验室生物安全操作失误或意外的处理

1.新型冠状病毒毒株或其他潜在感染性材料污染生物安全柜的操作台造成局限污染：使用有效氯含量为0.55%消毒液，消毒液需要现用现配，24h内使用，或75%酒精擦拭，紫外线照射30min以上。

2.含病毒培养器皿碎裂或倾覆造成实验室污染：保持实验室空间密闭，避免污染物扩散，使用0.55%有效氯消毒液的毛巾覆盖污染区。必要时（大量溢撒时）可用过氧乙酸加热熏蒸实验室，剂量为2g/m3，熏蒸过夜。或20g/L过氧乙酸消毒液用气溶胶喷雾器喷雾，用量8mL/m3，作用1～2h。必要时或用高锰酸钾一甲醛熏蒸：高锰酸钾8g/m3，放入耐热耐腐蚀容器（陶罐或玻璃容器），后加入甲醛（40%）10mL/m3，熏蒸4h以上。熏蒸时室内湿度 60%～80%。

3.清理污染物严格遵循活病毒生物安全操作要求，采用压力蒸汽灭菌处理，并进行实验室换气等，防止次生危害。

五、废弃物处置

1.开展新型冠状病毒相关实验活动的实验室应当制定废弃物处置程序文件及污物、污水处理操作程序。

2.所有的危险性废弃物必须依照统一规格化的容器和标示方式，完整并且合规地标示废弃物内容。

3.应当由经过适当培训的人员使用适当的个人防护装备和设备处理危险废弃物。

4.废弃物的处理措施：废弃物的处理是控制实验室生物安全的关键环节，切实安全地处理感染性废弃物，必须充分掌握生物安全废弃物的分类，并严格执行相应的处理程序。

（1）废液的处理：实验室产生的废液可分为普通污水和感染性废液。

①普通污水产生于洗手池等设备，对此类污水应当单独收集，排入实验室水处理系统，经处理达标后方可排放。

②感染性废液即在实验操作过程中产生的废水，采用化学消毒或物理消毒方式处理，并对消毒效果进行验证，确保彻底灭活。

③工作人员应当及时处理废弃物，不得将废弃物带出实验区。

（2）固体废物的处理：

①固体废物分类收集，固体废物的收集容器应当具有不易破裂、防渗漏、耐湿耐热、可密封等特性。实验室内的感染性垃圾不允许堆积存放，应当及时压力蒸汽灭菌处理。废物处置之前，应当存放在实验室内指定的安全地方。

②小型固体废物如组织标本、耗材、个人防护装备等均需经过压力蒸汽灭菌处理，再沿废弃物通道移出实验室。

③体积较大的固体废物如HEPA过滤器，应当由专业人士进行原位消毒后，装入安全容器内进行消毒灭菌。不能进行压力蒸汽灭菌的物品如电子设备可以采用环氧乙烷熏蒸消毒处理。

④经消毒灭菌处理后移出实验室的固体废物，集中交由固体废物处理单位处置。

⑤实验过程如使用锐器（包括针头、小刀、金属和玻璃等）要直接弃置于锐器盒内，高压灭菌后，再做统一处理。

5.建立废弃物处理记录：定期对实验室排风HEPA过滤器进行检漏和更换，定期对处理后的污水进行监测，采用生物指示剂监测压力蒸汽灭菌效果。