乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV，以下简称乙肝病毒），是一种嗜肝病毒，主要存在于肝细胞内并损害肝细胞，引起肝细胞炎症、坏死、纤维化。乙肝病毒可通过血液、唾液等途径传播，传染性是人类免疫缺陷病毒的100倍，这是我国为乙肝患病大国的主要原因。乙肝病毒对患者的危害很大。患者感染乙肝病毒后，短期内对身体健康并不会造成很大的损害，而发病时，往往已发展成慢性乙肝，治疗困难，且预后较差。
乙肝病毒感染具有五种特点：①嗜肝性：乙肝病毒通过肝细胞膜上的乙肝病毒受体直接与肝细胞膜结合，其病毒基因进入细胞内复制增殖。治疗药物必须是小分子才能进入细胞内，而且还要对肝细胞无毒性作用。②泛嗜性：乙肝病毒可以感染淋巴细胞不能到达的组织，如周围血单核细胞、脾、骨髓、淋巴结等。③变异性：乙肝病毒为逃避机体对其消除和杀伤而发生的变异，可在乙肝病毒结构的不同部位发生，变异可自发或在药物治疗后发生。变异的乙肝病毒影响对乙型肝炎的诊断、治疗和预防。乙肝病毒与人体细胞整合后，使人体免疫系统难以辨认，失去对乙肝病毒的监视和杀灭作用。④不可杀性：乙肝病毒进入人体的肝细胞，在细胞酶的作用下，最后形成共价闭合环状基因，它是形成乙肝病毒的原始模板，稳定地生存于细胞核内，不断地复制乙肝病毒。⑤母婴传播：携带乙肝病毒的母亲，通过宫内感染、分娩期及分娩后感染，将母体内的乙肝病毒传给新生儿，即垂直传播。我国人群中的乙肝病毒携带者半数以上是这样被感染的。初生时，免疫功能不健全、特异性免疫应答弱而不全、不能有效地识别病毒，表现为乙肝病毒免疫耐受，即人体感染乙肝病毒后无特异性免疫反应来消除病毒，最终成为乙肝病毒携带者。
2017年4月21日世界卫生组织发布的《2017年全球肝炎报告》显示，全球约有3.25亿人感染慢性乙肝病毒或丙肝病毒。这些病毒感染者中的绝大多数人无法获得可拯救生命的检测和治疗。因此，数百万人面临着发展到慢性肝病、癌症和死亡的风险。在我国，成人乙肝疫苗接种率是很低的。乙肝是我国社会负担较大的疾病之一。目前，我国约有1亿人为乙肝病毒携带者，占我国总人口数的8%～10%，慢性乙肝患者（肝脏已出现炎性病变）约2000万人。即使接种了乙肝疫苗，也有5%～10%的人对乙肝疫苗是无反应的，主要见于40岁以上、肥胖、饮酒、接受血液透析以及各种原因引起的免疫功能低下者。根据《2015年中国卫生和计划生育统计年鉴》的数据，我国乙肝病毒携带者人数在2012年和2013年呈升高的趋势。随着我国医疗保障体系的不断完善，越来越多原本隐匿存在的乙肝患者被陆续检测发现。
（二）乙肝疫苗简介
1.乙肝疫苗研发简史 乙肝疫苗接种是预防乙肝最有效的方法。1965年，Banuch Blumberg在一位澳大利亚土著居民的血液中发现了抗原性物质Aa（澳大利亚抗原）（后改称HBsAg），使得乙肝疫苗的研制成为可能，Banuch Blumberg因此获得1976年诺贝尔生理学或医学奖。1970年，伦敦Middlesex医院的D.S.Dane用电子显微镜发现了Aa阳性患者血样中的乙肝病毒颗粒。该病毒的最外层膜为乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg），也是乙肝疫苗的基本成分，20世纪80年代末完成了对乙肝病毒的基因测序工作。乙肝病毒感染肝细胞的关键是其表面蛋白和肝细胞结合，人体免疫系统产生的抗体会阻止这种结合，使得乙肝病毒不能感染肝细胞。乙肝病毒产生大量的表面抗原，使免疫系统产生的抗体无法完全阻断它们和肝细胞的结合，以量取胜，因此在感染者的血液中有多达5×1017个病毒表面抗原。
1981年，第一个获得美国FDA批准的乙肝疫苗上市。转基因技术革命性地变革了乙肝疫苗的制备工艺，人类设法分离出了HBsAg的基因，并将其转移到了酵母中，使得酵母可以合成HBsAg。酵母易大量繁殖，解决了疫苗原料的来源问题，使得疫苗大规模生产成为可能。1986年，转基因酵母乙肝疫苗获得美国FDA的上市批准。1994年，乙肝疫苗生产技术被引进中国。1997年，利用酵母生产的转基因乙肝疫苗在中国被正式批准生产。
2.乙肝疫苗的类型 血源性乙肝疫苗是采用HBsAg携带者的血清或血浆作为原料，经过化学浓缩，提纯其中的表面抗原而制成的乙肝疫苗。HBsAg携带者由于已感染乙肝病毒，在此情况下，再抽取其血浆作为乙肝疫苗原料，对携带者的身体健康有损害，疫苗的生产受到HBsAg携带者血浆来源和质量的限制，无法大规模稳定地生产，在HBsAg阳性血浆的采集、运输和加工过程中存在引发血源性传染病的可能，在血源性乙肝疫苗的生产过程中，虽然采用三步灭活工艺，但是三步灭活不足以将血源中所有已知和未知的潜在致病因子全部灭活，难以最大限度地保证血源性乙肝疫苗受种者绝对安全。这种疫苗现在已停止使用。
基因工程乙肝疫苗是一种HBsAg亚单位疫苗，它采用基因重组技术将表达HBsAg的基因进行质粒构建，克隆进入酿酒酵母中，通过培养这种重组酵母菌来表达HBsAg亚单位。这种HBsAg亚单位具有原料易得、产量大、安全、高效等特点，基因工程乙肝疫苗最早获得美国FDA批准。国内生产基因工程乙肝疫苗的技术均从美国引进。
（三）基因工程乙肝疫苗的制备
目前基因工程乙肝疫苗主要分为酵母（酿酒酵母和甲基营养型酵母）以及中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cell，CHO细胞）表达疫苗。现在介绍由重组酿酒酵母表达HBsAg经纯化，加入铝佐剂制成的重组乙肝疫苗（recombinant hepatitis B vaccine）。基因工程乙肝疫苗是通过构建含有HBsAg的重组质粒转染酵母细胞，制备HBsAg的有效蛋白。
目前基因工程乙肝疫苗使用重组酵母表达系统进行乙肝疫苗的大规模生产，有如下几点原因：①酵母对培养基的要求低，价廉易得；②酵母细胞生长快，故生产率高；③动物细胞生长慢，容易染菌，对操作要求严；④酵母系统容易放大，动物细胞系统放大难。
重组酵母构建过程包括五个步骤：①剪切：根据已测定的编码HBsAg表位基因序列，用化学合成法直接合成目的基因或者通过鸟枪法克隆目的基因。用识别相同黏性末端的限制性内切酶将外源DNA和质粒分子切开。②连接：用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段连接到质粒分子上，构建DNA重组分子。③转化：借助细胞转化手段将DNA重组分子导入酵母细胞内。④扩增：短时间培养转化酵母细胞，以扩增DNA重组分子。⑤检测：筛选和鉴定经转化处理的酵母细胞，获得外源基因高效表达的基因工程菌。(www.xing528.com)
乙肝疫苗制备工艺如下。
（1）生产用菌种：生产用菌种为基因重组技术构建的表达HBsAg的重组酿酒酵母原始菌种。
对成功构建的基因工程菌进行扩大培养，逐级放大至发酵罐。发酵过程应该具有下列特点：①原料以碳水化合物为主，不含有毒物质，并加入少量有机和无机氮源；②容易进行大量有效的HBsAg的生产；③生物反应过程是以自动调节方式进行的，多个反应像一个反应一样，在单一设备中进行；④生产过程常在常温进行，操作条件温和，不用考虑防爆问题；⑤能够高度选择性地进行复杂化合物在特定部分的反应，如氧化反应、还原反应、官能团导入反应；⑥生产过程中应考虑杂菌的污染问题。
（2）种子批的建立及检定：应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。构建的重组原始菌种经扩增1代为主种子批，主种子批扩增1代为工作种子批。
①培养物纯度：培养物接种于哥伦比亚血琼脂平板和酶化大豆蛋白琼脂平板上，分别于20～25℃和30～35℃培养5～7天，应无细菌和其他真菌被检出。②HBsAg基因序列测定：HBsAg基因序列应与原始菌种保持一致。③质粒保有率：采用平板复制法检测。将菌种接种到复合培养基上培养，得到的单个克隆菌落转移到限制性培养基上培养，计算质粒保有率，应不低于95%。④活菌率：采用血细胞计数板，分别计算每1 mL培养物中总菌数和活菌数，活菌率应不低于50%。⑤抗原表达率：取种子批菌种扩增培养，采用适宜的方法将培养后的细胞破碎，测定破碎液的蛋白质含量，并采用酶联免疫法或其他适宜方法测定HBsAg含量。抗原表达率应不低于0.5%。⑥菌种保存：主种子批和工作种子批菌种应于液氮中保存，工作种子批菌种于-70℃保存应不超过6个月。
（3）原液的制备。
①发酵：取工作种子批菌种，于适宜温度和时间经锥形瓶、种子罐和生产罐进行三级发酵，收获的酵母应冷冻保存。②纯化：用细胞破碎器破碎酿酒酵母，除去细胞碎片，以硅胶吸附法粗提HBsAg，疏水色谱法纯化HBsAg，用硫氰酸盐处理，经稀释和除菌过滤即得原液。③原液的保存：于2～8℃保存不超过3个月。④原液检定：特异蛋白带，采用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，应有分子质量为20～25 kD的蛋白带，可有HBsAg多聚体蛋白带。N-端氨基酸序列用氨基酸序列分析仪测定。纯度采用免疫印迹法测定，所测供试品中酵母杂蛋白应符合批准的要求；采用高效液相色谱法（HPLC）进行乙肝疫苗HBsAg的纯度检定是疫苗质量控制的关键手段之一。目前分析测定重组乙肝疫苗纯度的HPLC常用方法是应用TSKG5000PW分子筛方法。
（4）半成品的制备。
①甲醛处理：在原液中加入甲醛，于37℃保温适宜时间。②铝吸附：每1 μg蛋白质和铝剂按一定比例置2～8℃吸附适宜的时间，用无菌生理盐水洗涤，去上清液后再恢复至原体积，即为铝吸附产物。③配制：蛋白质浓度为20.0～27.0μg/mL的铝吸附产物可与铝佐剂等量混合，即为半成品。④半成品的检定：吸附完全性检定结果应不低于95%。硫氰酸盐含量检定结果应小于1.0μg/mL。
（5）成品的制备：所配制的半成品应按照“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”规定进行相应的分批、分装及冻干后包装。成品的检定：①鉴别试验：采用酶联免疫法检查，应证明含有HBsAg。②外观：应为乳白色混悬液体，可因沉淀而分层，易摇散，不应有摇不散的块状物。③pH：应为5.5～7.2。④铝含量：应为0.35～0.62 mg/mL。
（6）乙肝疫苗的保存：乙肝疫苗的稳定性较差，一般在2～8℃下能保存12个月，但当温度升高后，效力很快降低。在37℃下，许多疫苗只能稳定几天或者几小时，非常不利于在室温下运输。为了使疫苗的稳定性提高，可用冻干的方法使之干燥。这样，疫苗的有效期往往可延长1倍或以上，在室温下其效价的损失亦较慢。
冻干要点：①冷冻，即将疫苗冷冻至共熔点以下；②真空升华，即在真空状态下降温，水分直接由固态升华为气态；③升温缓慢，即升温的过程尽量缓慢，不使疫苗在任何时间下有融解的情况发生；④冻干好的疫苗应在真空或充氮气后密封保存，使其残余水分保持在3%以下。这样的疫苗能保持良好的稳定性。
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