控制种子质量的因素及影响

（一）影响孢子质量的因素及控制

生产过程中影响种子质量的因素通常有培养基、培养条件、培养时间和冷藏时间等。

1. 培养基

生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是培养基中的原材料质量波动。例如，由于生产蛋白胨所用的原材料及生产工艺的不同，蛋白胨中的微量元素含量、磷含量、氨基酸组成均有所不同，而这些营养成分对于菌体生长和孢子形成有重要作用。如微量元素Mg²⁺、Cu²⁺、Ba²⁺能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。不同厂家的琼脂可能会因含有不同的无机离子，对孢子的形成产生影响。另外，水质的影响也不能忽视，地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量。

主要控制措施：①为了保证孢子培养基的质量，斜面培养基所有的主要原材料，糖、氮、磷含量需经过化学分析和摇瓶发酵试验合格后才能使用；②制备培养基时，要严格控制灭菌后的培养基质量；③斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一段时间，使斜面无冷凝水出现，固体培养基水分适中有利于孢子生长；④供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，以抑制某些不正常菌落的出现，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源，便于选择特殊代谢的菌落；⑤为了避免水质波动对孢子质量的影响，可在蒸馏水或无盐水中加入适量的无机盐，供配制培养基使用。

2. 培养条件

（1）温度 温度对大多数菌种斜面孢子的质量有显著的影响。如土霉素生产菌种在高于37℃培养时，孢子接入发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。

（2）湿度 斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量有较大的影响。例如土霉素生产菌种龟裂链霉菌，在北方气候干燥地区，斜面上孢子长得较快，在含有少量水分的斜面试管培养基下部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干疤状，孢子稀少。在气温高、湿度大的地区，斜面上孢子长得慢，主要由于试管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。从表6-2中可以看出，相对湿度在40%～45%时孢子数量最多，且孢子颜色均匀，质量较好。

表6-2 不同相对湿度对龟裂链霉菌斜面生长的影响

3. 培养时间

固体孢子的生长繁殖可划分为三个生理阶段：营养菌丝繁殖、气生菌丝繁殖、分生孢子繁殖。营养菌丝和气生菌丝属于繁殖体，而孢子本身是一个独立的遗传体，属于相对独立的生理阶段，内含完整的遗传物质，孢子用于传代和保存均能保持原始菌种的基本特征。因此，一般以分生孢子进行传代和保存。但是孢子本身亦有年轻和衰老的区别，一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子。

过于年轻的孢子经不起冷藏，如土霉素菌种斜面培养4.5d，孢子尚未完全成熟，冷藏7～8d即开始自溶；如培养5d，孢子可完全成熟，冷藏20d也不自溶。过于衰老的老龄孢子导致生产能力下降，因为衰老的孢子核物质趋于分化状态，逐步进入发芽阶段，继续培养会产生二代菌丝。因此，在固体孢子制备过程中，应该严格控制在最佳阶段，一般是单一世代分生孢子生长繁殖的对数生长期，即孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。例如，四环素产生菌（金色链霉素）固体孢子工艺：

老工艺：沙土孢子→母斜面单菌落（37℃，168h）→子斜面（37℃，168h）→种子罐。

新工艺：沙土孢子→斜面孢子（35℃，100h）→种子罐。

老工艺培养168h的斜面孢子，经显微镜观察，多数孢子为空孢子不着染颜色。实际观察发现，斜面培养3d就已长出分生孢子，着色力强，4d呈游离孢子，7d呈空孢子。新工艺降低了培养温度至35℃，培养100h为分生孢子旺盛期，为种子质量的最佳阶段。可免去单菌落移种，保证了种子质量，又简化了种子制备工艺。

4. 冷藏时间

冷藏时间对孢子的生产能力也有影响，总的原则是宜短不宜长。例如在链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏2个月后的发酵单位比冷藏1个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。

斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。如土霉素生产菌种孢子斜面培养4d左右放于4℃冰箱保存，发现冷藏7～8d菌体细胞开始自溶。而培养5d以后冷藏，20d未发现自溶。

5. 接种量

孢子接种量大小影响种子罐液体培养基中孢子的数量，进而影响菌体的生理状况。青霉素产生菌之一的球状菌孢子数量过少，进罐后长出的球状过大，影响通气效果；若孢子数量过多，则进罐后不能很好维持球状菌体。黑曲霉发酵生产时，采用孢子或麸曲制成孢子悬液接入种子罐，接种量以10⁵个孢子/mL种子液为宜，于35℃左右静止培养（浸泡）5～6h，再接到种子罐中。一般来说，采用孢子进罐法时，若能将进罐前的固体孢子在水中浸泡数小时，进罐后有利于孢子发芽，更能取得同步生长的效果。

（二）影响种子质量的因素及控制

种子质量是发酵能否正常进行的重要因素之一，生产过程中影响种子质量的因素通常有培养基、培养条件、种龄、接种量等。

1. 培养基

种子培养基要满足的要求：①营养成分适合种子培养的需要；②选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基；③营养上要易于被菌体直接吸收和利用；④营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高；⑤营养成分要尽可能与发酵培养基相近。

2. 培养条件

（1）温度 微生物的生长温度和最适生长温度是不同的。微生物的生长温度范围比较宽，一般在24～37℃多数微生物都能生长。最适生长温度是指某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。种子培养阶段应控制在最适温度范围内。在最适温度范围内，组成菌体的蛋白质很少变性，所以在最适温度范围内可适当提高对数生长期的培养温度，既有利于菌体生长，又能避免热作用的破坏。为使种子罐培养温度控制在一定范围，生产上常在种子罐上安装有热交换设备，如夹套、蛇管或排管等进行温度调节。

（2）通气量 培养过程中通气搅拌很重要，各级种子罐或者同级种子罐的不同时期的需氧量是不同的。一般前期需氧量较少，后期需氧量较多，应适当增大通气量。在青霉素生产的种子制备过程中，充足的通气量可以提高种子质量，例如，将通气充足和通气不足两种情况下得到的种子接入发酵罐内，他们的发酵单位可相差一倍。但是，在土霉素发酵过程中，一级种子罐的通气量小一些却对发酵有利。通气搅拌不足可引起菌丝结团、菌丝粘壁等异常现象。

3. 种龄

种子的培养时间称为种龄，即种子罐中培养的菌（丝）体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。由于菌体在不同生长阶段其生理活性差别很大，种龄的控制就显得非常重要。表6-3列举了常见菌种种龄和培养温度。

表6-3 常见菌种种龄和培养温度

（1）种龄的确定 通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期的中后期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。因为处于对数生长期的菌体接种有利于缩短发酵周期，对数生长期末菌体浓度相对较高，更有利于保持高的接种量。种龄太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。例如，嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12h最好，如图6-9所示。

在土霉素生产中，一级种子的种龄相差2～3h，转入发酵罐后，菌体的代谢就会有明显的差异。同一菌种的不同罐批培养相同的时间，得到的种子质量也不完全一致，因此最适的种龄通过多次试验，特别要根据本批种子的质量来确定。

图6-9 种龄与碱性蛋白酶活力之间的关系

（2）菌体生产曲线 菌体细胞生长曲线就是把一定量的菌体细胞接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，细菌在新的适宜环境中生长繁殖直至衰老死亡全过程的动态有规律的变化，它能反映出菌体群体生长的规律。生长曲线大致分为延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段，如图6-10所示。

在发酵工程领域，通过研究生产曲线，可以了解发酵菌株在各个时期的特点和状态，尤其是对数期状态，这对于确定最佳的种子培养时间尤为重要。同时，测定了生产曲线，为研究如何缩短种子培养周期，确定最佳的接种时间和接种量，为提高发酵产量提供了依据。

测定微生物生长曲线的方法有以下几种：一是浊度法，澄清的培养液检查浊度，能及时反映低浓度单细胞（非丝状真菌，而指细菌、酵母细胞）的生长状况，可测定培养液的光密度（optical density，OD ）；二是菌落计数法，通过稀释涂布的方法测定不同时期活菌浓度，单位为CFU/mL（CFU指Colony Forming Units，即菌落形成单位）；三是重量法，测定菌体的鲜重或干重。浊度法测定OD值在工业生产、教学和科研工作中经常采用。

图6-10 单细胞微生物分批培养时的理想生长曲线

微生物OD值是反映菌体生产状态的一个指标，在一定范围内菌液浓度与OD值成正比，因此，可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，如图6-11所示。一般用505nm波长测菌丝体，560nm波长测酵母菌，600nm波长测细菌。

对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪时，可采用一种特制的有侧臂的三角烧瓶。将侧臂插入光电比色计的比色座孔中，即可随时测定其生长情况，而不必取菌液。该法主要用于发酵工业菌体生长监测。(www.xing528.com)

图6-11 某菌株Z15生长曲线图

4. 接种量

接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大，会移入过多代谢废物，同时引起溶氧不足，影响产物合成；过小，会延长培养时间，降低发酵罐的生产率，具体如表6-4所示。

表6-4 青霉素发酵罐生产种子罐种子液的接种量试验结果

注：发酵指数以接种量10%为对照。

在生产中，接种量通常：细菌1%～5%，酵母菌5%～10%，霉菌7%～15%。大多数抗生素发酵的最适接种量为7%～15%，有时可增加到20%～25%，而由棒状杆菌生产谷氨酸接种量只需1%。为了缩短生产阶段的发酵初始生长期，提高设备利用率，规模生产常采用大的接种量10%～20%。

走进企业 生产上获得高产的措施和接种方法

近年来，生产企业通过加大接种量和丰富培养基作为获得高产的措施，如谷氨酸生产中，采用高生物素、大接种量、添加青霉素的工艺。为了加大接种量，有些品种的生产采用 “双种法”；有时因为种子罐染菌或种子质量不理想而采用“倒种法”；有时两个种子罐中只有一个染菌可采用 “混种法”。几种接种方法如图6-12所示。

图6-12 几种接种方法

①—单种 ②—双种 ③—倒种 ④—混种

“双种法”就是2个种子罐的种子接入1个发酵罐的接种方法；“倒种法”就是以适宜的发酵液倒出部分对另一个发酵罐作为种子的接种方法；“混种法”就是以种子液和发酵液混合作为发酵罐种子的接种方法。三种方法运用得当，有可能提高发酵产量，但会增加染菌和变异的机会。

（三）种子质量的控制措施

1. 种子质量标准

不同菌种以及不同工艺的种子质量有所不同，况且，判断种子质量的优劣尚需要有丰富的实践经验。发酵工业生产上常用的种子质量标准，大致有如下几个方面。

（1）细胞或菌体 种子培养的目的是获得健壮和足够数量的菌体，因此，菌体形态和菌体浓度是种子质量的重要指标。单细胞菌体要求菌体健壮、形态一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态；霉菌、放线菌要求菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。此外，种子液外观如颜色、黏度等也可作为种子质量的粗略指标。

（2）生化指标 通过测定种子液中糖、氮、磷的含量，以及pH变化来确定种子的质量。

（3）产物生成量 在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。

（4）酶活力 种子液中，某种酶的活力与目的产物的产量密切相关，因此，可以间接反映种子的质量。测定种子液中某种酶的活力，作为种子质量标准，是一种较新的方法。如土霉素生产所用种子液中的淀粉酶活力与土霉素发酵单位有一定关系，因此，种子液淀粉酶活力可作为判断该种子质量的依据。

2. 种子质量的控制措施

（1）无（杂）菌检查 在种子制备过程中每次移种一次均需对种子液进行无（杂）菌检查，目前常用方法主要有镜检、划线或肉汤培养的无菌检验及生化分析等。

镜检是以视野中不出现异常形态菌体为依据。生产菌与杂菌的形态特征一般是不同的，如发现有与生产菌形态特征不一样的其他微生物存在，就可判断为发生了染菌。镜检的方法具有快速及时的特点，是生产上对种子质量进行跟踪的常用方法。操作人员首先要对生产菌的形态特征比较熟悉，然后才能够对种子液是否染菌做出准确判断。

划线或肉汤培养是将种子液样品涂在平板培养基上划线培养或接入到酚红肉汤培养基培养而进行的无菌检验。肉眼观察平板上是否出现异常菌落，酚红肉汤是否由红变黄。如果肉汤连续三次发生变色反应（红色→黄色）或产生浑浊，或平板培养连续三次发现有异常菌落的出现，即可判断为染菌。

种子液生化分析项目主要是取样测定其营养消耗的速率、pH变化、溶解氧变化以及色泽气味是否异常等。

（2）菌种稳定性检查 菌种质量控制的重要措施是定期进行菌种的分离筛选。通常情况下随着菌种的传代使用，菌种出现一定衰退，比较稳定的菌种2个月应进行一次分离纯化，不稳定的菌种应每月进行一次分离纯化。

（3）控制每批生产斜面的使用时间 一般情况下细菌斜面保存时间不宜超过30d，有的菌种不宜超过10d，否则菌种生产能力会有所下降。

3. 种子异常现象及分析

在种子制备过程中，经常会出现菌种生长发育缓慢或过快、菌丝结团、菌丝粘壁及代谢不正常等异常现象，表示种子质量差，需重新制种。

（1）菌种生长发育缓慢或过快 这种现象是指在各项工艺参数正常的情况下，出现代谢过慢或过快，代谢过慢的原因一般是孢子质量差、空气温度较低或培养基消毒质量较差。

（2）菌丝结团 在深层培养条件下，繁殖的菌丝不分散舒展而聚集成团状称为菌丝团。菌丝结团影响菌的呼吸和对营养的吸收。菌丝结团可能与接入的孢子量、通气搅拌的效果有关。

（3）菌丝粘壁 所谓菌丝粘壁是指在种子培养过程中，菌丝正常生长发育，但培养到一定时间时，菌丝会粘附在瓶壁或罐壁上。以霉菌为产生菌的种子培养过程易出现菌丝粘壁现象。菌丝粘壁的原因可能与搅拌效果不好，泡沫过多以及种子罐的装料系数过小等有关。

（4）种子代谢异常 种子异常还表现在代谢情况上，如糖、氮代谢过快或过慢，pH过高或过低，种子效价过低等。因此，检定种子的质量时，不仅以表观参数为指标，更主要的要从代谢上来分析其内在的变化规律。根据生产实践，无论一级、二级（甚至三级）种子罐都有一定的代谢规律，如果发现上述糖、氮代谢，pH和种子效价等异常情况，均为异常种子。异常种子不能接入发酵罐，否则在发酵过程中必将出现代谢不正常或目标产物生物合成能力下降的现象。

4. 种子染菌及其处理

杂菌的污染称为染菌，种子染菌将直接影响发酵。种子培养时，微生物菌体浓度低，培养基的营养十分丰富，易染菌。若将污染的种子带入发酵罐，则危害极大，因此，应严格控制种子染菌，对已染菌的种子液及时加以处理。

（1）种子染菌的危害 种子染菌的危害表现：①微生物之间的营养竞争；②一些杂菌的代谢产物改变种子液的pH或代谢物的毒性抑制生产菌的生长；③某些杂菌产生的酶，如青霉素酶会破坏抗生素的化学结构；④某些杂菌的代谢物会改变发酵液的物理性质，使发酵液黏度增加，影响菌丝过滤。

（2）种子染菌的原因 种子染菌的原因主要包括：①斜面菌种不纯；②培养基和设备管道灭菌不彻底（如假压）；③无菌操作不严致使移种污染；④空气净化系统不良；⑤设备、管道和阀门漏损等。

（3）控制措施 严格控制接种室的污染，交替使用各种灭菌手段对接种室进行消毒处理。对沙土管、斜面及摇瓶均应严格管理，防止杂菌进入。接种过程要严格按照规范的无菌操作要求进行。各级种子培养基或设备管道灭菌时要有足够的灭菌时间和温度，杜绝 “假压力”，避免 “死角”，确保灭菌彻底。定期检查空气过滤器是否失效或减效并及时更换。如果新菌种不纯，需反复分离，直至完全纯粹为止。平时应经常分离试管菌种，以防止菌种衰退、变异和污染杂菌。

（4）种子培养期染菌的处理 一旦发现种子染菌，该种子不能再接入发酵罐进行发酵，应灭菌后弃之，并对种子罐和管道等仔细检查和彻底灭菌。如有备用种子，选择生长无染菌的种子接入发酵罐，继续发酵生产；如无备用种子，则可选择一个适当菌龄的发酵罐内的发酵液作为种子，进行“倒种”处理，接入新鲜的培养基中进行发酵，从而保证发酵生产正常进行。