实时荧光定量PCR：基因表达研究的一大飞跃

1.实验原理

实时荧光定量PCR技术利用PCR进入指数增长期的快慢与起始模板数之间的严格函数关系，以外标准品建立的标准曲线为尺码，针对待测样本直接定量或相对定量，是目前最精确的核酸定量技术之一。由于其将实验过程和产物分析测定合为一体，实现了PCR全程自动化操作和闭管检测，最大限度地避免了实验室污染，一经问世即得到普遍应用和广泛认可。

2.几种常用的荧光定量PCR技术

（1）TaqMan探针

美国Perkin Elmer（PE）公司于1995年开发的水解探针技术是当前使用最广泛的主流技术之一。在PCR反应液中加入一条靶基因特异的荧光标记寡核苷酸探针，其5'端标记了一个荧光报告基团（reporter），3'端标记了一个荧光淬灭基团（quencher）。当外界激发光激发荧光报告基团发出一定波长的荧光后，荧光能量被淬灭基团吸收而无法被有效检测。在PCR扩增过程中，TaqMan探针与靶基因序列杂交，并在延伸过程中被具有5'-3'外切功能的Taq DNA聚合酶切割水解，使荧光报告基团与荧光淬灭基团分离。此时处于游离状态的报告基团能够在激发光作用下发出荧光，从而被荧光监测系统识别出来。由于在PCR反应过程中每扩增一条DNA链，就有一个游离荧光分子形成，因此，根据荧光报告基团产生荧光信号的强弱，即可测算出PCR反应产物的数量（如图4-1）。

图4-1　TaqMan探针原理

TaqMan探针技术建立在Taq DNA聚合酶外切功能的基础上，只有当探针与靶基因序列结合并被聚合酶水解，才会产生特定波长的荧光。由此决定了TaqMan探针技术的高特异性，即使探针与DNA序列发生非特异性结合，在不发生模板扩增的情况下也不会产生假阳性信号。

TaqMan探针技术的主要缺陷在于游离的荧光分子无法被再度淬灭，因而随PCR反应进行，体系中的游离荧光分子会不断累计增多；探针长期存放后也可能因为降解产生较多游离荧光分子，从而导致较高的背景荧光值，影响数据的准确性。目前TaqMan探针的设计与合成已在我国实现商品化，每条探针的合成费用约1000元人民币。

（2）荧光谐振能量传递（FRET）

FRET是由罗氏（Roche）公司开发的双探针杂交技术。在PCR反应体系中加入两条荧光标记的寡核苷酸探针，分别与待扩增的靶基因目标区域完全互补，且在序列上首尾相接，其间只隔1～3个碱基。在上游探针的3'端和下游探针的5'端分别标记上不同的荧光基团，前者的发射波长正好在后者的激发波长范围内。在PCR反应的复性阶段，两条探针分别与靶基因序列结合，标记在上游探针上的荧光给予基团在激发光作用下发出的荧光，以能量共振方式转移到下游探针的荧光接受基团上，从而激发接受基团发出可检测的荧光。(www.xing528.com)

（3）分子信标（molecular beacon）

分子信标是较早期的杂交探针技术，在PCR反应体系中加入一条特别设计、具有“发夹”结构的荧光标记探针。这条分子信标探针除了一个和靶基因序列完全匹配的核心区域外，两侧还分别具有一段互补的寡核苷酸序列，因此在游离状态下，能通过两侧的互补序列形成自身发夹结构。探针两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团。

（4）SYBR Green Ⅰ

SYBR Green I是一种无毒无害的高灵敏性DNA荧光染料，能特异性嵌入双链DNA小沟位置，在497nm波长的激发光作用下产生520m波长强烈荧光。与DNA结合的SYBR Green I染料的发光能力比游离分子强约1000倍，所以体系内双链DNA浓度与检测到的荧光强度基本成正比关系。

PCR反应体系中加入低浓度SYBR Green I染料后，在每一循环的延伸期定时收集荧光信号，荧光信号随模板DNA扩增逐渐增强，最终得到一条实时扩增曲线。SYBR Green I与双链DNA的结合没有靶序列特异性和温度敏感性，通用性好；但避免了探针技术中严格的设计合成环节。目前国内市场上商品化的SYBR Green qPCR试剂盒可低至每反应数元人民币，检测成本大大低于各类探针技术。而且SYBR Green I荧光分子不随扩增的进行而消耗，可始终保持较高的荧光效率（如图4-2）。

图4-2　SYBR Green I原理示意图

SYBR Green I的最大缺陷是缺乏特异性保证，检测到的荧光信号除来自扩增的靶序列产物之外，还包括了非特异性扩增产物与引物二聚体等其他双链DNA分子与荧光染料结合产生的荧光。对荧光信号特异性的判断是定量检测的关键，实验室内通常采用凝胶电泳或熔点曲线法衡量特异性荧光信号的强弱。即使如此，由于无法从荧光信号中筛滤非特异成分，SYBR Green I技术在准确性上仍与探针技术存在一定差距。

总之，实时荧光定量PCR技术的发展是基因表达研究领域在方法学上的一大飞跃。将具高特异性、敏感性的PCR技术与先进的荧光技术相结合，实现了对痕量基因产物的精确测定；实现了全程闭管操作和实验检测一体化，污染风险远低于常规PCR，敏感性和特异性均优于传统的半定量PCR，相关技术优势突出，已被国际广泛认可，为核酸定量领域新一代的金标准。