细胞工程技术与细胞融合技术简介

细胞工程技术是细胞生物学与遗传学的交叉领域，是按照人们预先的设计，利用细胞生物学的原理与方法，并结合工程学的技术手段，使细胞遗传特性得以有目的地改变的技术。其主要包括细胞培养技术、细胞融合技术、细胞拆合技术与细胞重组技术、转基因生物反应器等。

（一）细胞培养技术

细胞培养技术是指在无菌条件下，在体外模拟体内的生理环境，将动、植物细胞从有机体分离出来进行培养并使之生存、生长和增殖的技术。细胞培养包括原核生物细胞、真核单细胞、植物细胞与动物细胞培养以及与此密切相关的病毒的培养。

（1）动物细胞培养。

体外培养的动物细胞可分为原代培养（primary culture）与传代培养（subculture）。原代培养是指直接从有机体取出细胞、组织或器官后立即进行培养。原代培养的细胞一般传至10代，就会出现大部分细胞衰老死亡的情况。因此，通常把传至10代以内的细胞统称为原代细胞。从培养瓶中将原代培养的细胞取出，以1∶2以上的比例扩大培养，为传代培养。在原代细胞培养中，也有少数细胞可以继续传下去，可传40～50代，且染色体二倍性和接触抑制行为仍保留，这种类型的细胞称为细胞株（cell strain）。因此，细胞株是通过选择法或克隆法从原代培养物中获得的具有特殊性质或标志的培养细胞。在传代培养过程中，细胞可能发生遗传突变，表现出癌细胞的特点，可以在体外培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称为细胞系（cell line）。细胞系细胞的特点是染色体数目明显改变，失去接触抑制的特点，易于传代培养。如HeLa细胞系、CHO细胞系（中国仓鼠卵巢细胞）、BHK-21细胞系（仓鼠肾成纤维细胞）等。

动物细胞培养分为贴壁培养和悬浮培养。体外培养的细胞，无论原代细胞还是传代细胞通常不能保持其体内原有的细胞形态。分散的细胞悬浮在培养瓶中很快（几十分钟至数小时内）就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。贴壁生长的细胞大体可分为两种基本形态，成纤维样细胞（fibroblast like cell）与上皮样细胞（epithelial like cell）。细胞经贴壁就迅速铺展呈多形态，此后细胞开始有丝分裂，逐渐形成致密的细胞单层，称为单层细胞（monolayer cell）。当贴壁生长的细胞分裂生长到表面相互接触时，分裂增殖就会停止，这种现象称为接触抑制（contact inhibition）。为此，贴壁生长的细胞增殖到近于汇合时，必须重新分散后分瓶继续培养，其分裂增殖才能够继续下去。悬浮培养的细胞在培养瓶中不贴壁，一直悬浮在培养液中生长，如淋巴细胞。悬浮培养的条件较为复杂，难度相对较大，但大量培养细胞的获得要相对容易一些。

体外培养的动物细胞对营养和环境条件的要求很高。营养物质必须与体内相同，由培养基提供。培养基通常含有细胞生长所需的氨基酸、维生素、糖和微量元素。培养基可分为天然培养基和合成培养基。一般合成培养基在培养细胞中使用得比较多，但在使用合成培养基时需要添加一些天然成分，其中最重要的是血清，这是因为血清中含有多种促细胞生长因子和一些生物活性物质。环境因素主要是指无菌环境、合适的温度（35～37℃）、一定的渗透压、合适的气体环境（O2和CO2）和适宜的pH（7.2～7.4）。

（2）植物细胞培养。

植物细胞培养是指离体的植物器官、组织或细胞，在对其培养一段时间之后，会通过细胞分裂形成愈伤组织。由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化，或者称为去分化。脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程称为再分化。再分化形成的试管苗移栽到地里，可以发育成完整的植物体。植物细胞培养主要有如下几种技术。

①组织培养：先诱导产生愈伤组织，如果条件适宜，可分化培养出再生植株。用于研究植物的生长发育、分化和遗传变异，或进行无性繁殖。

②悬浮细胞培养：在愈伤组织培养技术基础上发展起来的一种培养技术。植物细胞悬浮体系由于分散性好、细胞性状及细胞团大小一致，而且具有生长迅速、重复性好、易于控制等特点，较为适合进行产业化大规模细胞培养，获得植物次生代谢产物。

③原生质体培养：脱除细胞壁后的植物细胞称为原生质体（protoplast），其特点如下。比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；便于进行细胞融合，形成杂交细胞；与完整细胞一样，具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化形成完整植株。

④单倍体培养：利用植物的单倍体细胞进行体外培养获得单倍体植株。通常用花药或花粉培养可获得单倍体植株，再经人为加倍后可得到完全纯合的个体。

（二）细胞融合技术

细胞融合技术是近年来迅速发展起来的一项新兴细胞工程技术。细胞融合（cell fusion）也称细胞杂交（cell hybridization），是指细胞通过介导和培养，在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合（合并）成一个核或多核的杂合细胞的过程。这个杂合细胞得到了来自两个细胞的遗传物质（包括细胞核的染色体组合和核外基因），具有新的遗传或生物特性。细胞融合技术不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等领域的研究提供了有力的手段，而且在遗传学、免疫学以及医药、食品、农业等方面都有广泛的应用价值。此外，细胞融合技术在单克隆抗体的制备、哺乳动物的克隆以及抗癌疫苗的研发中已成为关键技术。

（1）细胞融合常用技术。

①仙台病毒诱导法：活的或灭活的仙台病毒均可促进动物细胞融合。但该方法存在病毒制备困难，操作复杂，灭活病毒的效价差异大，试验重复性差，融合率低等问题。目前该方法主要用于实验室研究。

②聚乙二醇（PEG）诱导法：自1975年之后，利用PEG诱导细胞融合逐渐替代仙台病毒在细胞融合中的地位，发展成为一种规范的重要化学融合方法，它将病毒法诱导的细胞融合率从1/105提高到了1/103。此外，PEG诱导法的优点是没有种间、属间、科间的特异性或专一性，动植物间的限制也被打破。该法的缺点在于PEG对细胞的毒性大，极大地影响了融合后细胞的存活率。这种方法一直沿用至今，即使到了电融合技术已成熟的今天，PEG诱导法依然以其低廉的试验成本和相对高的融合率被大量应用。

③电脉冲诱导法：该技术产生于20世纪80年代，目前已成为细胞融合的主要手段之一。该技术融合率高，是PEG诱导法融合率的100倍。电脉冲诱导法操作简便、快速，对细胞损伤小，可以免去细胞融合后的洗涤操作，可应用于不同的细胞。

（2）细胞融合新技术。(www.xing528.com)

鉴于细胞融合在生物、医学、药学方面的巨大潜在应用价值，来自物理、电子、生物、医学领域的各国科学家在此领域开展了专项研究。目前，基于微流控芯片的细胞融合技术已成为细胞融合技术研究的重点领域，利用该技术，可以使细胞之间实现可控融合。这势必对未来杂交瘤细胞的制备、克隆技术以及对基因表达的研究等方面产生重大影响，有望为细胞融合技术带来一次新的革命。

（三）细胞拆合技术与细胞重组技术

细胞拆合（nuclear transplantation）技术是指把完整细胞的细胞质和细胞核用特殊的方法分离开来，或把细胞核从细胞质中吸取出来，或用紫外线等把细胞中的核杀死，然后把分离的同种或异种的细胞核和细胞质重新组合起来，形成一个新的细胞或新的生物个体。细胞拆合技术也已成为一种十分重要的现代生物技术。

细胞重组（cell reconstruction）技术是指细胞工程中将细胞融合技术与细胞核质分离技术结合，即在融合介质的诱导下，将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞的过程。细胞重组技术为重新构成不同类型的杂种细胞提供了可能，尤其是细胞重组结合基因转移可以人为地使细胞表达新的性状和产生新的产物，因此，细胞重组技术备受瞩目。

细胞重组的方式有三种：①胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种；②微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体；③胞质体与核体重组形成重组细胞。

上面提及的胞质体、微细胞、核体均为细胞重组的原料。胞质体是除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。植物去核原生质体又称微质体或亚原生质体。微细胞是只有一条或几条染色体和一薄层细胞质，外面包裹一层完整的细胞质膜的核质体。这种只能存活几小时的微细胞，如果用细胞融合的方法将其与完整的体细胞融合，把它的染色体转入受体细胞，可重新组成存活正常的杂交细胞。

胞质体与核体的重组，即核移植，它是利用显微操作技术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或者将两个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造无性杂交新品种的一种技术。细胞核移植技术是克隆的重要基础，也是现代细胞工程领域最活跃的一个研究热点。

（四）转基因生物反应器

转基因生物反应器（transgenic bioreactor）是指将外源基因转入生物体，利用该工程化的生物体制备外源基因表达的活性物质。这里的生物体充当的其实就是一种载体。转基因生物反应器主要包括细胞水平上的三种转基因生物反应器和个体水平上的两种转基因生物反应器，分别为转基因微生物生物反应器、转基因动物细胞生物反应器、转基因植物细胞生物反应器，以及转基因动物和植物生物反应器。

（1）转基因微生物生物反应器。

微生物由于结构简单、繁殖迅速、容易培养而成为转基因对象，主要采用遗传背景清楚的大肠杆菌和酵母表达系统，通过高密度发酵培养、分离纯化获得所需要的目的产物。用工程微生物生产的药物属于第一代基因工程药物。

（2）转基因动物细胞生物反应器。

将外源基因转入动物细胞，从而表达制备相关产品的方法。利用转基因动物细胞生产蛋白药物、疫苗、细胞因子等产品已经成为生物制药的热点。哺乳动物细胞已成为生物药物最重要的表达或生产系统。用工程哺乳动物细胞生产的药物属于第二代基因工程药物。例如，EPO为高度糖基化的蛋白药物，具有相对分子质量大、空间结构复杂的特点，其生产只能使用CHO等哺乳动物细胞表达系统。

（3）转基因植物细胞生物反应器。

将外源基因转入植物细胞，从而表达制备相关产品的方法。由于植物细胞大规模培养技术限制，目前利用转基因植物细胞大规模生产基因工程产品有一定的难度。

（4）转基因动、植物生物反应器。

将外源基因转入动、植物个体，从而表达制备相关产品的方法。转基因动、植物生物反应器不仅限于转基因技术，而且还涉及植物组织培养、动物胚胎工程等技术，因此过程复杂。

转基因动物（transgenic animal）是指在基因组内稳定地整合外源基因，并且外源基因可以稳定地遗传给后代的基因工程动物。利用转基因动物生产人类药用蛋白等是目前世界上转基因动物研究的热点之一。如何将导入的药用蛋白基因控制在某一特定部位，成为利用转基因动物生产药用蛋白的一个关键的技术问题。就药用蛋白而言，最理性的表达场所为乳腺。因为乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，因此，不会影响到转基因动物本身的生理代谢反应。同时，从转基因乳汁中获取的目的基因产物，不但产量高、易提纯，而且表达的蛋白质经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性，这也被称为转基因动物乳腺生物反应器。用乳腺表达人类所需的药用蛋白产物的牛、羊等就相当于一座制药工厂，用这种手段生产的药物，被称为第三代基因工程药物。工程细菌、工程动植物细胞培养等均需要较大的车间，特别是后者的培养成本非常高，而转基因动物生物反应器则只需养殖动物即可。例如，2006年全球首个利用转基因动物乳腺生物反应器生产的基因重组药物——AT Ⅲ获批上市。此外，已经证明利用转基因猪的血液生产具有生物活性的人类血红蛋白是可行的，这被称为转基因动物血液生物反应器。

转基因植物（transgenic plant）是指将外源基因转入植物的细胞或组织中而获得新的遗传性状的植物。1992年，美国Arntzen和Mason率先提出用转基因植物生产疫苗的新思路。此后，国内外相继在烟草、马铃薯、番茄、苜蓿和莴苣中表达了乙型肝炎病毒表面抗原、大肠杆菌热敏毒素B亚基、霍乱毒素B亚基、诺瓦克病毒壳蛋白和狂犬病毒G蛋白等抗原，并利用在植物中表达的抗原进行了动物和人体的免疫试验，这为利用转基因植物生产疫苗奠定了良好基础。目前，已有包括表皮生长因子、人血清白蛋白等在内的几十种药用多肽或蛋白在烟草等植物中成功表达。