微生物生长的规律与特点

微生物特别是单细胞微生物，体积很小，个体的生长很难测定，而且也没有什么实际应用价值。因此，测定它们的生长不是依据细胞个体的大小，而是测定群体的增加量，即群体的生长。

一、微生物的个体生长和同步生长

细菌的细胞是极其微小的，但是，与一切其他细胞或个体一样，也有一个自小到大的生长过程。在整个生长过程中，细胞内发生阶段性的十分复杂的生物化学变化和细胞学变化。可是，要研究单个细菌的这类变化，技术上是十分困难的。目前能使用的方法，一是用电子显微镜观察细菌细胞的超薄切片；二是使用同步培养技术，即设法使群体中的所有细胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂周期中，然后分析此群体的各种生物化学特征，从而了解单个细胞所产生的变化。

细菌最主要的繁殖方式是二分裂，就是在细菌细胞生长到一定阶段时，一分为二，由一个细胞变成两个子细胞。细菌二分裂时，细胞中的遗传物质即DNA先进行复制，然后在细胞的中央形成横隔壁，最后子细胞分裂，每个子细胞都具有一个DNA分子。在少数细菌中，还存在着其他的繁殖方式，如不等二分裂、出芽繁殖、三分裂和多分裂等。不等二分裂是二分裂的变体形式，柄细菌的繁殖就是一个典型的例子。柄细菌的形态很有趣，它仅在一端生出一根鞭毛（细菌的运动“器官”）。繁殖前，在生鞭毛的一端长出一个柄，此时，鞭毛就消失了，之后，细胞伸长，在细胞的另一端长出一根鞭毛。细胞分裂后，形成形态不同的两个子细胞，一个有柄但无鞭毛，另一个只有鞭毛却无柄。有鞭毛的细胞生长到一定阶段，又开始上述的不等二分裂繁殖过程。

微生物生长旺、繁殖快，以惊人的速度“生儿育女”。例如大肠杆菌在合适的生长条件下，12.5～20min便可繁殖一代，每小时可分裂3次，由1个变成8个。每昼夜可繁殖72代，由1个细菌变成4722366500万亿个（重约4722t）；经48h后，则可产生2.2×10⁴³个后代，如此多的细菌的重量约等于4000个地球之重。由于种种条件的限制，这种疯狂的繁殖是不可能实现的。细菌数量的翻番只能维持几个小时，不可能无限制地繁殖。因而在培养液中繁殖细菌，它们的数量一般仅能达到每毫升1亿～10亿个，最多达到100亿。尽管如此，它的繁殖速度仍比高等生物高出千万倍。微生物的这一特性在发酵工业上具有重要意义，可以提高生产效率，缩短发酵周期。微生物个体生长是微生物群体生长的基础。但群体中每个个体可能分别处于个体生长的不同阶段，因而它们的生长、生理与代谢活性等特性不一致，出现生长与分裂不同步的现象。

同步培养是一种培养方法，它能使群体中不同步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。以同步培养方法使群体细胞处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长方式称为同步生长。通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞或同步培养物。同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。用一般培养方法获得的细胞通常是不完全同步的细胞，就是同步培养方法获得的同步细胞经几次传代之后，也会出现不同步的现象。如何使不同步转变为同步，以及如何使用同步细胞能较长时间地保持同步，这是同步培养中要研究的课题。

同步培养方法很多，可归纳为机械法与环境条件控制两类。

1.机械方法

机械方法是一类根据微生物细胞在不同生长阶段的细胞体积与质量或根据它们同某种材料结合能力不同的原理设计出来的方法。其中常用的如下。

（1）离心方法 将不同步的细胞培养物悬浮在不被这种细菌利用的糖或葡聚糖的不同梯度溶液里，通过密度—梯度离心将不同细胞分布成不同的细胞带，每一细胞带的细胞大致是处于同一生长期的细胞，分别将它们取出进行培养，就可以获得同步细胞。

（2）过滤分离法 将不同步的细胞培养物通过孔径大小不同的微孔滤器，从而将大小不同的细胞分开，分别将滤液中的细胞取出进行培养，获得同步细胞。

（3）硝酸纤维素滤膜法 根据细菌能紧紧结合到硝酸纤维素滤膜上的特点，将细菌悬液通过垫有硝酸纤维素滤膜的过滤器，然后将过滤器颠倒过来，再将培养基流过过滤器，以洗去未结合的细菌，然后将滤器放入适宜条件下培养一段时间，其后仍将培养基流过过滤器，这时新分裂产生的细菌被洗下，分部收集并通过培养获得同化细胞。

2.环境条件控制技术

这类技术是根据细菌生长与分裂对环境因子要求不同的原理设计的一类获得同步细菌的方法。

（1）温度 最适生长温度有利于细菌生长与分裂，不适宜温度如低温不利于细菌生长与分裂。通过适宜与不适宜温度的交替处理之后，通过培养可获得同步细胞。

（2）培养基成分控制 培养基中的碳、氮源或生长因子不足，可导致细菌缓慢生长直至生长停止。因此将不同步的细菌在营养不足的条件下培养一段时间，然后转移到营养丰富的培养基里培养，能获得同步细胞。另外也可以将不同步的细胞转接到含有一定浓度的，能抑制蛋白质等生物大分子合成的化学物质如抗生素等的培养基里，培养一段时间后，再转接到完全培养基里培养也能获得同步细胞。

（3）其他 对于光合细菌可以将不同步的细菌经光照培养后再转到黑暗中培养，这样通过光照和黑暗交替培养的方式可获得同步细胞；对于不同步的芽孢杆菌培养至绝大部分芽孢形成，然后经加热处理，杀死营养细胞，然后转接到新的培养基里，经培养可获得同步细胞。

环境条件控制获得同步细胞的机理不完全了解。这种处理可能是导致胞内某些物质合成，合成和积累可导致细胞分裂，从而获得同步细胞。

二、微生物的生长曲线及对其生产实践的指导意义

任何生物都有出生、发育、繁殖、衰老和死亡的过程，微生物也不例外。不过，微生物的生长规律和大生物有些不同，大生物通常是以一个个体为对象，而微生物的生长通常指细胞数目的增加。定量研究液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线称为微生物生长曲线。将少量纯种微生物细胞接种到容积恒定的液体培养基上，在合适的环境下，细胞就会由小变大，发生有规律的生长。若以细胞数的对数为纵坐标，培养时间为横坐标，就可以绘出单细胞微生物的典型生长曲线（见图7-1）。一般该生长曲线只适用于单细胞微生物，包括细菌和酵母菌。生长曲线代表细菌在一个新的适宜的环境中生长繁殖以至衰老死亡的全部过程的动态。由生长曲线图可以看出，整个生长过程可以分为适应期、对数增长期（指数期）、稳定期和衰亡期4个时期。

（一）适应期

适应期又称延迟期、缓慢期、停滞期、调整期。指少量微生物接种到新培养液中后，在开始培养的一段时间内细胞数目不增加或增加非常缓慢的时期。该时期有几个特点：生长繁殖的速度几乎等于零；细胞形态增大，杆菌的长度增加。例如，巨大芽孢杆菌在接种的当时，细胞长为3.4μm，培养至3.5h，其长为9.1μm，至5.5h时，竟可达到19.8μm；细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性；合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶；对外界不良条件（例如：NaCl溶液浓度、温度和抗生素等化学药物）的反应敏感。

处于延迟期细菌细胞的特点可概括为8个字：分裂迟缓、代谢活跃。细胞体积增长较快，尤其是长轴，在延迟期末，细胞平均长度比刚接种时大6倍以上；细胞中RN A含量增高，原生质嗜碱性加强；对不良环境条件较敏感，对氧的吸收、二氧化碳的释放以及脱氨作用也很强，同时容易产生各种诱导酶等。这些都说明细胞处于活跃生长中，只是细胞分裂延迟。在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。

图7-1 单细胞微生物生长曲线

1、2—适应期 3—对数增长期 4、5—稳定期 6—衰亡期

延迟期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境条件等因素有关，短的只需几分钟，长的可达几小时。因此，深入了解延迟期产生的原因，采取缩短延迟期的措施，在发酵工业上具有十分重要的意义。在生产实践中，通常采取的措施有增加接种量，在种子培养中加入发酵培养基的某些营养成分，采用最适种龄（即处于对数期的菌种）的健壮菌种接种以及选用繁殖快的菌种等措施，以缩短延迟期，加速发酵周期，提高设备利用率。

影响延迟期长短的因素很多，除菌种外，主要有以下影响因素。(www.xing528.com)

（1）菌种的菌龄 菌龄即“种子”的群体生长年龄，亦即它处在生长曲线上的哪一个阶段。这是一种生理年龄，实验证明，如果以对数期的“种子”接种，则子代培养的适应期就短，如果以稳定期的“种子”接种，则适应期就相对较长。

（2）接种量 接种量的大小明显影响适应期的长短。一般说来，接种量大，则适应期短，反之则长。因此在发酵工业上，为缩短不利于提高发酵效率的适应期，一般采用1/10的接种量。

（3）培养基成分 接种到营养丰富的天然培养基中的微生物要比接种到营养单调的合成培养基中的适应期短。新接种的培养基与菌种的原培养基越接近，适应期就越短。所以，在发酵生产中，常使发酵培养基的成分与种子培养基的成分尽量接近。

延迟期的出现，可能是因为在接种到新鲜培养液的细胞中，一时还缺乏分解或催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢物。为产生诱导酶或与合成有关的中间代谢物，就需要有一段适应期，于是出现了生长的延迟期。

（二）对数增长期

对数增长期又称为指数增长期，是指在生长曲线中，紧接着适应期的一个细胞以几何级数速度分裂的一段时期。对数增长期有以下几个特点：生长繁殖的速度很快，活菌的数目呈对数增长，因而细胞每分裂一次所需的代时G或原生质增加1倍所需的时间最短，并且在这个时期内均匀一致；细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最为均匀；酶系活跃，代谢旺盛；在此时期内，菌细胞的形态特征均匀一致，最代表种的特征；此时期内的微生物的生化特性均匀一致，并且典型。

对数期中，细胞代谢活性最强，组成新细胞物质最快，所有分裂形成的新细胞都生活旺盛。这一阶段的突出特点是细菌数以几何级数增加，代时稳定，细菌数目的增加与原生质总量的增加，与菌液混浊度的增加均呈正相关性。这时，细菌纯培养的生长速率也就是群体生长的速率，可用代时表示。所谓代时，即单个细胞完成一次分裂所需的时间，亦即增加一代所需的时间（也称增代时间或世代时间）。在此阶段，由于代时稳定，因此，只要知道了对数期中任何两个时间的菌数，就可求出细菌的代时。也就是1个细菌繁殖“n”代产生了2ⁿ个细菌。如果在时间t₀时菌数为x，经过一段时间，到t₁时，繁殖“n”代后，菌数为y，则代时（G）可以下式表示：

不同的细菌，其对数期的代时不同，同一种细菌，由于培养基组成和物理条件的影响，如培养温度、培养基pH、营养物的性质等，代时也不相同。但是，在一定条件下，各种菌的代时又是相对稳定的，多数种为20～30min，有的长达33h，而有的繁殖极快，增代时间只有9.8min左右。

影响指数期微生物增代时间的因素很多，主要有以下几种。

1.菌种

不同菌种的代时差别极大。

2.营养成分

同一种细菌，在营养物丰富的培养基中生长其代时较短，反之较长。

3.营养物浓度

营养物的浓度可影响微生物的生长速率和总生长量。在营养物浓度很低的情况下，其才会影响生长速率，随着营养物浓度的逐步增高，生长速率不受影响，而只影响最终的菌体产量。如果进一步提高营养物的浓度，则生长速率和菌体产量两者均不受影响。凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物，就称生长限制因子。

4.培养温度

温度对微生物的生长速率有极其明显的影响。指数期的微生物因其整个群体的生理特性较一致、细胞成分平衡发展和生长速率恒定，故可作为代谢、生理等研究的良好材料，是增殖噬菌体的最适宿主菌龄，也是发酵生产中用作“种子”的最佳种龄。

（三）稳定期

稳定期又称恒定期或最高生长期，其特点是生长速率常数等于0，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长相等的动态平衡之中。稳定期到来的原因主要是：营养物尤其是生长限制因子的耗尽；营养物的比例失调，例如C/N比值不合适等；酸、醇、毒素或H₂O₂等有害代谢产物的累积；pH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜等。

在此阶段的初期，细胞分裂的间隔时间延长，曲线上升开始缓慢，随后部分细胞停止分裂，少数细胞开始死亡，致使新生细胞与死亡细胞处于动态平衡状态，这时的活细胞总数达到最高水平，在稳定期的后期，死亡细胞的速率大于新生细胞的速率，曲线出现下降的趋势，在此时期内，细胞内开始积累贮藏物，如肝糖颗粒、异染颗粒、脂肪颗粒等。大多数能形成芽孢的细菌在此时期内形成芽孢，在此时期内，细胞的次级代谢产物大量积累，菌细胞的总数也达到最高峰。所以稳定期是以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物，例如单细胞蛋白、乳酸等为目的的一些发酵生产的最佳收获期。这一时期也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段，某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期，芽孢细菌也在此阶段形成芽孢，也是对某些生长因子例如维生素和氨基酸等进行生物测定的必要前提。此外，由于对稳定期到来的原因进行研究，还促进了连续培养技术的设计和研究。

如果为了获得大量菌体，就应在此阶段收获，因这时细胞总数量最高；可以看出，稳定期的微生物，在数量上达到了最高水平，产物的积累也达到了高峰，此时，菌体的总产量与所消耗的营养物质之间存在着一定关系，这种关系，生产上称为产量常数，可用下式表示：

Y＝菌体总生长量/消耗营养物质总量

式中，Y值的大小可说明该种细菌同化效率的高低。根据这一原理，可用适当的微生物作为指示，对维生素、氨基酸或核苷酸等进行定量的生物测定。稳定期的长短与菌种和外界环境条件有关。生产上常常通过补料、调节pH、调整温度等措施，延长稳定期，以积累更多的代谢产物。

（四）衰亡期

稳定期后如再继续培养，细菌死亡率逐渐增加，以致死亡数大大超过新生菌数，群体中活菌数目急剧下降，出现了“负生长”，此阶段称为衰亡期。在衰亡期中，个体死亡的速度超过新生的速度，因此，整个群体就呈现出负生长。产生衰亡期的原因主要是外界环境对继续生长越来越不利，从而引起细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体死亡。

衰亡期细胞形态出现不正常，呈多样性，细胞种的特征典型，生理生化出现异常。例如：有的微生物因蛋白水解酶活力的增强就发生自溶，有的微生物在这时产生或释放对人类有用的抗生素等次生代谢产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。在芽孢杆菌中，芽孢释放往往也发生在这一时期。菌体细胞也呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有的细胞内多液泡，革兰氏染色反应的阳性菌变成阴性反应等。