“色”，即色泽，是食品色、香、味、形等感官质量指标中最为重要的特征之一。为了改善食品的色泽，GB 2760-2014中规定了食品中允许添加的着色剂如辣椒红、胡萝卜素、藻蓝素、可可色素、焦糖色素等，但是在食品生产中，也存在个别非法添加非食用物质如苏丹红、王金黄、美术绿等现象，为防止这些行为的发生，国家加强了对这类非食用着色物质的测定。
苏丹红又名“苏丹”（sudan），为亲脂性偶氮化合物，主要包括苏丹红Ⅰ（1－苯基偶氮－2－萘酚）、苏丹红Ⅱ（1－［（2，4－二甲基苯）偶氮］－2－萘酚）、苏丹红Ⅲ（1－［4－（苯基偶氮）苯基］偶氮－2－萘酚）和苏丹红Ⅳ（1-2－甲基－4－［（2－甲基苯）偶氮］苯基偶氮－2－萘酚）等四种类型，苏丹红Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ均为苏丹红Ⅰ的化学衍生物，与苏丹红Ⅰ主体结构相同，均有致癌性，但具体结构间存在个别差异。
苏丹红的相对分子质量为248.29，黄色粉末状，不溶于水，微溶于乙醇，易溶于油脂、矿物油、丙酮和苯。“苏丹红”并非食品添加剂，而是一种人工合成的红色染料，常作为一种工业染料，被广泛用于如溶剂、油、蜡、汽油的增色以及鞋、地板等增光方面。由于苏丹红价格低廉，一些不法商贩用其充当食品着色剂使用的现象时有发生。由于苏丹红的一些代谢产物可能是致癌物，因此应尽可能避免摄入这些物质。
苏丹红的测定方法主要有色谱法、质谱法、气谱－质谱联用法、光谱分析法、电化学分析法、酶联免疫吸附法、分子印迹技术等。其中GB/T 19681-2005《食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法》是卫生部发布的食品中可能违法添加的非食用物质黑名单中指定的分析方法。
（一）实验原理
样品经溶剂提取、固相萃取净化后，用反相高效液相色谱（紫外可见光检测器）进行色谱分析，采用外标法定量。
（二）试剂和仪器
1.试剂
（1）甲酸（分析纯）；乙醚（分析纯）；正己烷（分析纯）；无水硫酸钠（分析纯）；乙腈（色谱纯）；丙酮（色谱纯、分析纯）。
（2）层析柱管1cm（内径）×5cm（高）的注射器管。
（3）层析用氧化铝（中性100～200目）105℃干燥2h，于干燥器中冷至室温，每100g中加入2mL水降活，混匀后密封，放置12h后使用。
（4）氧化铝层析柱 在层析柱管底部塞入一薄层脱脂棉，干法装入处理过的氧化铝至3cm高，轻敲实后加一薄层脱脂棉，用10mL正己烷预淋洗，洗净柱中杂质后，备用。
（5）5%丙酮的正己烷液 吸取50mL丙酮用正己烷定容至1L。
（6）标准物质 苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ，纯度≥95%。
（7）标准储备液 分别称取苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ及苏丹红Ⅳ各10.0mg（按实际含量折算），用乙醚溶解后用正己烷定容至250mL。
2.仪器
高效液相色谱仪（配有紫外可见光检测器）；分析天平（感量0.1mg）；旋转蒸发仪；均质机；离心机；0.45μL有机滤膜。
（三）实验步骤
1.样品处理
（1）红辣椒粉等粉状样品 称取1～5g（准确至0.001g）样品于三角瓶中，加入10～30mL正己烷，超声5min，过滤，用10mL正己烷洗涤残渣数次，至洗出液无色，合并正己烷液，用旋转蒸发仪浓缩至5mL以下，慢慢加入氧化铝层析柱中，为保证层析效果，在柱中保持正己烷液面为2mm左右时上样，在全程的层析过程中不应使柱干涸，用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶，一并注入层析柱。控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于0.5cm，待样液完全流出后，视样品中含油类杂质的多少用10～30mL正己烷洗柱，直至流出液无色，弃去全部正己烷淋洗液，用含5%丙酮的正己烷液60mL洗脱，收集、浓缩后，用丙酮转移并定容至5mL，经0.45μm有机滤膜过滤后待测。
（2）红辣椒油、火锅料、奶油等油状样品 称取0.5～2g（准确至0.001g）样品于小烧杯中，加入适量正己烷溶解（约1～10mL），难溶解的样品可于正己烷中加温溶解。按（1）中“慢慢加入到氧化铝层析柱……过滤后待测”操作。
（3）辣椒酱、番茄沙司等含水量较高的样品 称取10～20g（准确至0.01g）样品于离心管中，加10～20mL水将其分散成糊状，含增稠剂的样品多加水，加入30mL正己烷∶丙酮=3∶1，匀浆5min，3000r/min离心10min，吸出正己烷层，于下层再加入20mL×2次正己烷匀浆，离心，合并3次正己烷，加入无水硫酸钠5g脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持5min，用5mL正己烷溶解残渣后，按（1）中“慢慢加入到氧化铝层析柱……过滤后待测”操作。
（4）香肠等肉制品 称取粉碎样品10～20g（准确至0.01g）于三角瓶中，加入60mL正己烷充分匀浆5min，滤出清液，再以20mL×2次正己烷匀浆，过滤。合并3次滤液，加入5g无水硫酸钠脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸至5mL以下，按（1）中“慢慢加入到氧化铝层析柱中……过滤后待测”操作。
2.液相色谱参考条件
色谱柱：Zorbax SB－C18（或相当型号色谱柱）；流动相：溶剂A——0.1%甲酸的水溶液∶乙腈=85∶15；溶剂B——0.1%甲酸的乙腈溶液∶丙酮=80∶20；梯度洗脱：流速：1mL/min，柱温：30℃，检测波长：苏丹红Ⅰ478nm；苏丹红Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ520nm；于苏丹红Ⅰ出峰后切换，进样量：10μL。梯度洗脱条件如表6-2所示。
表6-2 梯度洗脱条件
续表
3.标准曲线绘制
吸取标准储备液0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mL，用正己烷定容至25mL，此标准系列浓度为0、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56μg/mL，绘制标准曲线。
4.结果计算
按式（6-1）计算苏丹红含量
式中 X——样品中苏丹红含量，mg/kg；
ρ——由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度，μg/mL；
V——样液定容体积，mL；
m——样品质量，g。
（四）注意事项
不同厂家和不同批号氧化铝的活度有差异，须根据具体购置的氧化铝产品略作调整，活度的调整采用标准溶液过柱，将1μg/mL的苏丹红的混合标准溶液1mL加到柱中，用5%丙酮正己烷溶液60mL完全洗脱为准，4种苏丹红在层析柱上的流出顺序为苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅲ，可根据每种苏丹红的回收率作出判断。苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ的回收率较低表明氧化铝活性偏低，苏丹红Ⅲ的回收率偏低时表明活性偏高。
王金黄学名碱性橙Ⅱ（Basic OrangeⅡ），是一种偶氮类碱性染料，相对分子质量248.72，闪光棕红色结晶块或砂状。红褐色结晶性粉末或带绿色光泽的黑色块状晶体。溶于水呈带黄的橙色，溶于乙醇和溶纤素，微溶于丙酮，不溶于苯。为致癌物，主要用于纺织品、皮革制品及木制品的染色。根据美国卫生研究所（NIH）化学品健康与安全数据库资料表明：过量摄取、吸入以及皮肤接触该物质均会造成急性和慢性的中毒伤害。由于碱性橙Ⅱ比其他水溶性染料如柠檬黄、日落黄等更易于在豆腐以及鲜海鱼上染色且不易褪色，因此一些不法商贩用碱性橙Ⅱ对豆腐皮、黄鱼进行染色，以次充好，以假乱真，欺骗消费者。
食品中王金黄的测定方法有：气－质联用法、高效液相色谱法和反相高效液相色谱法等。本文采用液相色谱法检测食品中的王金黄。
（一）实验原理
试样中的目标化合物用乙腈∶水（7∶3）提取，用高效液相色谱C18柱分离，紫外检测器检测，外标法定量。
（二）试剂及仪器
1.试剂
（1）乙酸铵、无水乙酸为分析纯，甲醇、乙腈为色谱纯，试验用水均为超纯水。
（2）标准储备液的配制 准确称取0.0100g酸性黄、酸性橙Ⅱ、碱性橙、碱性玫瑰精标准品于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容。
（3）标准使用液 分别吸取1.0mL酸性黄、酸性橙Ⅱ、碱性橙、碱性玫瑰精的标准储备液到10mL容量瓶中用水定容至刻度为中间使用液，再分别取0.1、0.5、1.0、2.0、5.0mL中间使用液到1mL容量瓶中用水定容至刻度，四种组分的标准系列为：1、5、10、20、50μg/mL。
（4）提取液 乙腈∶水=7∶3。
2.仪器
高效液相色谱仪，配备有Waters－Allains2695泵控及自动进样系统；Waters－2996二极管阵列检测器；离心机；超声振荡器。
（三）实验步骤
1.样品处理
准确称取2～5g样品于50mL塑料离心管中，加入10mL提取液，超声提取20min后，以1000r/min离心10min，取20μL液相色谱测定。
2.液相色谱参考条件
色谱柱：Inertsil ODS－34.6mm×250mm，5μm；流动相：A：乙腈；B：10mmol/L乙酸铵水溶液（乙酸0.12%）；梯度洗脱（如表6-3所示）；波长：酸性黄、酸性橙Ⅱ、碱性橙，450nm；碱性玫瑰精，550nm；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；进样体积：20μL。
分别取标准和样品各20μL进样，HPLC测定，外标法定量。
表6-3 梯度洗脱条件
3.结果计算
按式（6-2）计算王金黄含量
式中 X——样品中待测组分的含量，μg/g；
ρ——样品中待测组分的测定浓度，μg/mL；
m——样品重量，g。
玫瑰红B也称罗丹明B（Rhodamine B），俗称花粉红，相对分子质量479.0175，结构式如图6-1所示，是一种具有鲜桃红色的人工合成的染料，主要用于造纸工业染蜡光纸、打字纸、有光纸等。深红色结晶或红棕色粉末。溶于水及酒精中（呈带强荧光的蓝光红色溶液），易溶于溶纤素，微溶于丙酮。遇浓硫酸呈黄光棕色，有强的绿色荧光，稀释后呈大红色转为蓝光红色和橙色。由于玫瑰红B具有脂溶性，曾被用作食品添加剂添加于调味品（主要是辣椒粉和辣椒油）起染色作用。一般成年人食用含有玫瑰红B的食物30min开始感觉头晕，心烦，小便呈淡玫瑰红色，皮肤黏膜也染成玫瑰红色，不痒。半数致死量（小鼠，腹腔）150mg/kg。
图6-1 玫瑰红B
食品中玫瑰红B的测定方法有：液质联用法、高效液相色谱荧光检测法、高效液相色谱紫外检测法、试剂盒快速检测法等。本文介绍卫生部推荐方法液相色谱法。(www.xing528.com)
（一）实验原理
试样中的目标化合物用乙腈∶水（7∶3）提取，用高效液相色谱C18柱分离，紫外检测器检测，外标法定量。
（二）试剂和仪器
1.试剂
（1）乙酸铵、无水乙酸为分析纯，甲醇、乙腈为色谱纯，试验用水均为超纯水。
（2）标准储备液的配制 准确称取0.0100g酸性黄、酸性橙Ⅱ、碱性橙、碱性玫瑰精标准品于10mL棕色容量瓶中，用甲醇醇溶解并定容至刻度。
（3）标准使用液 分别吸取1.0mL酸性黄、酸性橙Ⅱ、碱性橙、碱性玫瑰精的标准储备液到10mL容量瓶中用水定容至刻度为中间使用液，再分别取0.1、0.5、1.0、2.0、5.0mL中间使用液到1mL容量瓶中用水定容至刻度，四种组分的标准系列为：1、5、10、20、50μg/mL。
（4）提取液 乙腈∶水=7∶3。
2.仪器
高效液相色谱仪，配备有Waters－Allains2695泵控及自动进样系统；Waters－2996二极管阵列检测器；离心机；超声振荡器。
（三）实验步骤
1.样品处理
准确称取2～5g样品于50mL塑料离心管中，加入10mL提取液，超声提取20min后，以1000r/min离心10min，取20μL液相色谱测定。
2.液相色谱参考条件
色谱柱：Inertsil ODS－34.6mm×250mm，5μm；流动相：A：乙腈；B：10mm乙酸铵水溶液（乙酸0.12%）；梯度洗脱：如表6-4所示；波长：酸性黄、酸性橙Ⅱ、碱性橙450nm；碱性玫瑰精550nm；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；进样体积：20μL。
表6-4 梯度洗脱条件
3.结果计算
分别取标准和样品各20μL进样，HPLC测定，外标法定量。
按式（6-3）计算玫瑰红B含量
式中 X——样品中待测组分的含量，μg/g；
ρ——样品中待测组分的测定浓度，μg/mL；
m——样品重量，g。
（四）注意事项
如果样品中色素干扰较多，可在氧化铝固相萃取小柱上分离。本办法对不同的色素可同时测定。
碱性嫩黄（Auramine O），旧称盐基淡黄O或盐基槐黄，又称奥拉明O。黄色粉末，工业染料，一般只能用于染布。主要用于醋纤、棉织品的染色，还用于纸张、皮革、油漆等的着色。难溶于冷水和乙醚，易溶于热水和乙醇。相对分子质量303.84。由于能起染色作用，一些不法商贩把碱性嫩黄加入到腐竹中。碱性嫩黄对皮肤黏膜有轻度刺激，可引起结膜炎、皮炎和上呼吸道刺激症状，人接触或者吸入碱性嫩黄都会引起中毒。颜色过于黄的腐竹可能加入了碱性嫩黄。
碱性嫩黄的检测方法为高效液相色谱法。
（一）实验原理
样品用乙腈提取后用正己烷脱脂净化，然后在碱性条件下用乙醚萃取，最后溶于甲醇中进行HPLC分离、检测。
（二）试剂和仪器
1.试剂
（1）甲醇、醋酸铵、冰醋酸、氨水、CH2Cl2、十二烷基磺酸钠为分析纯，实验用水为去离子水，碱性嫩黄O（pure，Acros）。
（2）称取碱性嫩黄O 0.01g，用甲醇溶解并定容于100mL容量瓶，配制成100μg/mL的标准储备液，使用时逐级稀释成标准工作溶液（0.1～50μg/mL）。将V冰醋酸∶V甲醇=l∶3的比例配制提取液。
2.仪器
高效液相色谱系统：WatersSl0泵配，Waters486紫外可见检测器，UV3100紫外分光光度计（Hitachi），KQ－500DB型数控超声波清洗器。
（三）实验步骤
1.样品处理
样品粉碎均匀后称取2.5g样品于烧杯中，加入提取液20mL，超声提取30min，过滤，再分别用20mL、10mL甲醇提取两次，过滤，合并滤液，氨水调节滤液至弱碱性。将滤液转移至分液漏斗，向其中加入20mL去离子水、20mL CH2Cl2，振摇、静置、分层，收集下层溶液，再分别用20mL和10mL CH2Cl2萃取两次。合并3次萃取液，浓缩至近干，定容至2.5mL，用0.45μm尼龙滤膜过滤，待测。
2.液相色谱参考条件
色谱柱为SytmmtryshieldTMRPl8（4.6mm×250mm，5μm），柱温35℃，检测波长430nm，流动相A：甲醇，经0.50μm有机相滤膜抽滤；流动相B：0.1mol/L醋酸铵、0.002mol/L十二烷基磺酸钠，用醋酸调节pH至4.5，经0.45μm水相滤膜抽滤。流动相A和流动相B按6∶4的比例以1.0mL/min流速进行。选择430nm作为检测波长。流动相选择V甲醇∶V水=6∶4，pH为4.5，20%醋酸的甲醇作为提取液。
3.标准曲线的绘制
将浓度为0.5、1、10、20、50μg/mL的碱性嫩黄O标准溶液依次进样，以色谱峰面积对浓度作图，得到工作曲线。
4.样品测定
将处理得到的待测样品过高效液相色谱，以得到的色谱峰面积在工作曲线上查得浓度。
酸性橙，又叫“酸性金黄”，是皂黄（Metanil yellow）的别称，相对分子质量452.380。主要用于纺织品、皮革制品、塑料及木制品的染色。酸性橙Ⅱ为中等毒性致癌化合物，禁止在食品中使用。由于酸性橙具有色泽鲜艳，着色稳定，价廉，经长时间烧煮、高温消毒而不分解褪色等特点，一些不法商贩为使卤制品卖相好看，可能存在非法添加。
酸性橙Ⅱ的测定方法有纸层析法和分光光度法等，这些方法操作时间长，定量精度差。而高效液相色谱（HPLC）法测定食品中酸性橙Ⅱ的方法快速、准确，适用于食品中合成食用色素与非食用色素酸性橙Ⅱ的同时测定。
（一）实验原理
食品中非食用色素酸性橙Ⅱ经提取制成水溶液，注入高效液相色谱仪，经反相色谱分离，根据保留时间定性，采用外标法进行定量。
（二）试剂和仪器
1.试剂
（1）重蒸馏水、乙酸、甲醇（色谱纯）、聚酰胺粉（过200目筛）、乙酸铵溶液（0.02mol/L）、柠檬酸溶液、无水乙醇－氨水－水溶液、酸性橙Ⅱ、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄。
（2）酸性橙Ⅱ标准溶液 准确称取干燥的酸性橙标样0.1000g，蒸馏水溶解，定容至100mL，此溶液1mL含1.00mg酸性橙Ⅱ。临用时，用蒸馏水稀释至1mL含10mg的酸性橙Ⅱ标准使用液。
（3）混合着色剂标准溶液 准确称取按其纯度折算为100%质量的柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、酸性橙Ⅱ各0.100g，置100mL容量瓶中，加水（pH=6）到刻度，配成水溶液（1.00mg/mL），临用时，用水稀释经0.45μm滤膜过滤，配成每毫升含各种标准物质10μg的混合着色剂标准使用液。
2.仪器
高效液相色谱仪：Waters 515泵，Waters紫外可见波长检测器；KQ－100DB型数控超声波清洗器；离心机。
（三）实验步骤
1.样品处理
（1）液体样品 饮料实验前，对于含二氧化碳试样应预先加热驱除二氧化碳；配制酒类加热驱逐乙醇，可不经稀释，过0.45μm滤膜后测定。
（2）固体样品 糕点类、卤制品类、灌制品类、辣椒面等样品，称样5.00～10.00g，粉碎混匀，加无水乙醇－氨水－水（70+1+29）溶液20mL，振摇0.5h，过滤，洗滤渣2次，合并滤液，用水（pH6）定容，过0.45μm滤膜测定。
（3）乳制品 可称量5.00g试样，按GB5009.23-2003聚酰胺吸附法提取色素，经0.45μm滤膜过滤测定。
2.液相色谱参考条件
色谱柱：DiamonsilTM（钻石）C185μm，4.6mm×200mm色谱柱；流动相：A：0.02mol/L甲醇；B：醋酸铵；流速：1.0mL/min，梯度洗脱；进样量：20μL；柱温：室温；紫外可变波长检测器：λ=484nm；流动相的选择：采用甲醇+醋酸铵体系作流动相，试剂价格便宜、易得，采用梯度洗脱可以同时测定柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄。
3.线性范围
对酸性橙Ⅱ在0～200μg/mL的范围内配制标准溶液系列9点，每标样进3针，以标样的峰面积的平均值为纵坐标，以标样的浓度为横坐标，绘制标准曲线，并利用最小二阶乘法进行线性回归，得到在0～100μg/mL范围内的线性方程。
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