氨基酸的检验方法及作用解析

氨基酸是蛋白质的基本结构单元。食品中除少量的游离氨基酸外，绝大多数氨基酸是以蛋白质形式存在，食品蛋白质的水解物中，通常含有20多种氨基酸。食品中氨基酸的分离分析方法，主要有紫外-可见分光光度法、荧光分光光度法、色谱法等。

1.电位甲醛滴定法测定氨基酸含量

（1）原理。氨基酸有氨基及羧基两性基团，它们相互作用形成中性内盐，利用氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出来酸性，用氢氧化钠标准溶液滴定后定量，根据酸度计指示pH值，控制终点。

（2）试剂。

甲醛（36%）：应不含有聚合物。

氢氧化钠标准滴定溶液［c（NaOH）=0.050mol/L］。

（3）仪器。

酸度计：包括标准缓冲溶液和KCl饱和溶液；

20mL移液管；

10mL微量滴定管；

L00mL容量瓶；

250mL烧杯。

（4）测定方法。

吸取5.0mL试样，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀，备用。

吸取上述稀释液20.00mL置于200mL烧杯中，加水60mL水，插入电极，开动磁力搅拌器，用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至酸度计指示pH=8.2，记录消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数（可计算总酸含量）。

向上述溶液中准确加入10.0mL甲醛溶液，混匀。再用氢氧化钠标准滴定溶液继续滴定至pH=9.2，记录加入甲醛后滴定所消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数。

取80mL水，先用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至酸度计指示pH=8.2，再加入10.0mL甲醛溶液，混匀，再用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至pH=9.2，记录加入甲醛后滴定所消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数。

（5）结果计算。试样中氨基酸态氮的含量为(www.xing528.com)

式中：X——试样中氨基酸态氮的含量，g/100mL；

V1——测定用试样稀释液加入甲醛后消耗标准碱液的体积，mL；

V2——测定空白试验加入甲醛后消耗标准碱液的体积，mL；

c——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；

0.0140——与1.00mL氢氧化钠标准滴定溶液［c（NaOH）=1.000mol/L］相当的氮的质量，g；

V3——总酸的含量，mL。

计算结果保留两位有效数字。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

（6）注意事项。

加入甲醛后放置时间不宜过长，应立即滴定，以免甲醛聚合，影响测定结果。由于铵离子能与甲醛作用，样品中若含有铵盐，将会使测定结果偏高。

2.茚三酮比色法测定氨基酸含量

（1）原理。茚三酮与氨基酸在弱酸性条件下一起加热，茚三酮转化为还原型水合茚三酮，氨基酸的a—NH：和—COOH被氧化，脱氮、脱羧产生氨和CO2。还原型水合茚三酮、茚三酮与氨作用，产生蓝紫色化合物，脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应，生产黄色物质。其反应为

（2）测定方法要点。称取0.6g结晶茚三酮，加15mL正丙醇。溶解后加入30mL正丁醇和6mL乙二醇，最后加入9mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液，储于暗处备用。

称取80℃烘干的亮氨酸46.8mg，溶于10%异丙醇中并稀释至100mL，取此液5mL加水定容至50mL，即为5μg/mL的标准溶液。

吸取样液1～4mL于试管中，加水1mL，加0.1mL 0.1%抗坏血酸溶液和3mL茚三酮溶液，摇匀。沸水浴加热15min，取出冷水浴迅速冷却，静置15min，使加热形成的红色被空气氧化褪色至蓝紫色。用60%乙醇溶液定容至20mL，混匀，测吸光度值。

取0～5mg标准氨基酸系列做标准曲线。

（3）说明。显色反应的茚三酮试剂，随着时间推移发色率会降低。