1.影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
高效液相色谱法与气相色谱法在基本概念、术语和基本理论等方面都基本一致，如保留值、分配系数、分配比、分离度、塔板理论、速率理论等，区别在于流动相的不同。因此，在高效液相色谱分析中，各组分的分离及色谱峰的扩展过程也符合速率理论方程（即范弟姆特方程）式，影响因素同样是涡流扩散项、分子扩散项和传质阻力项，即
式中 A——涡流扩散项；
B——分子扩散系数；
C——传质阻力系数；
H1——涡流扩散项；
H2——分子扩散项；
Hs——固定相传质阻力项；
Hm——流动的流动相中的传质阻力项；
Hsm——滞留的流动相中的传质阻力项。
（1）涡流扩散项H1 样品注入色谱柱后，在流动相驱动下不可能沿直线运动，而是不断改变方向，形成涡流般的曲线运动。由于样品在不同流路中受到的阻力不同，使其在柱中的运动速度有快有慢，同时运动路径长短不一，结果使到达出口的时间不同，导致峰型扩散。涡流扩散仅与固定相的粒度和柱填充的均匀度有关。
（2）分子扩散项（纵向扩散项）H2 当试样分子随着流动相从色谱柱经过时，由分子本身运动引起的纵向扩散同样会导致色谱峰的扩展，从而引起色谱峰形的扩散，即纵向扩散项。分子扩散与分子在流动相中的扩散系数成正比，而与流动相的线速度成反比。样品在色谱柱中滞留的时间越长，分子扩散就会越严重。由于分子在液体中的扩散系数比在气体中的要小4～5个数量级，因此在液相色谱中，当流动相的线速度大于0.5cm/s时，分子扩散对色谱峰扩展的影响实际可达忽略的地步。
（3）传质阻力项 在液相色谱法中，传质阻力项又可分为两项，即固定相传质阻力项和流动相传质阻力项。
1）固定相传质阻力项Hs：主要发生在液-液分配色谱中。试样分子自流动相进入固定液内和从固定相流出进入流动相时，会引起色谱峰扩展。对于液-液分配色谱，应设法使用薄的固定相液膜；对于吸附色谱、空间排阻色谱以及离子交换色谱，应尽量使用小颗粒固定相。
2）流动相传质阻力项：试样分子在流动相中的传质过程有两种形式，即在流动的流动相中传质以及在滞留的流动相中传质。
①流动的流动相中的传质阻力项Hm。当流动相流过色谱柱内的填充物时，处于不同层流的流动相分子具有不同的流速，靠近填充物颗粒的流动相要比中心层流的流动速度小，即在柱内流动相的流速并非是均匀的，因此产生峰形扩展。
②滞留的流动相中的传质阻力项Hsm。固定相的多孔性，使部分流动相溶剂滞留其中且停止不动。流动相中的组分分子欲到达孔穴内的固定相表面进行质量交换，需首先经过滞留区中的滞留流动相。若孔穴既小又深，则这部分的传质速率必然很小，结果会加剧峰的扩展。
综上所述，对于高效液相色谱法而言，纵向扩散项可略而不计，影响柱效能的主要因素是传质阻力项。提高液相色谱的分离效率，应通过减小柱填料的粒度，改善填充均匀性来实现。与气相色谱一样，液相色谱分析中各种影响柱效能的因素也是相互联系和相互制约的。比如，选用低黏度的流动相或适当提高柱温来降低流动相黏度，有利于传质，但提高柱温会降低分辨率；降低流动相流速对减小传质阻力项的影响显然是有利的，但同时又会增加纵向扩散项，使分析周期延长。
2.定性和定量方法
（1）定性方法 由于液相色谱过程中影响溶质迁移的因素较多，同一组分在不同色谱条件下的保留值相差较大，即使在相同操作条件下，同一组分在不同色谱柱上的保留值也可能有很大差别，因此液相色谱比气相色谱定性难度更大，但方法原理与气相色谱定性方法相同。
（2）定量方法 高效液相色谱的定量方法，主要还是面积归一化法、内标法和外标法。
3.试验技术
（1）溶剂的纯化 尽管分析纯和优级纯溶剂在大多数情况下都可以满足色谱分析的要求，但是不同的色谱柱和检测方法对溶剂的要求不同，如用紫外检测时，溶剂中就不能含有在检测波长下有吸收的杂质。目前，色谱分析用的“色谱纯”溶剂除最常用的甲醇外，其余多为分析纯，有时要进行除去紫外杂质、脱水、重蒸等纯化操作。
分析纯的乙腈是常用的流动相溶剂，但其还含有少量的丙酮、丙烯脂、丙烯醇和恶唑化合物，产生较大的背景吸收。通常采用活性炭或酸性氧化铝吸附的方法对其加以纯化，也可采用高锰酸钾/氢氧化钠氧化裂解与甲醇共沸的方法使之纯化。
四氢呋喃不太稳定，故其中加入了抗氧化剂BHT（二丁基烃基甲苯），可用蒸馏的方法将其除去，但应在使用前进行蒸馏，否则长时间地放置又会使其氧化，而且在使用前应检查有无氧化产物。检查方法为：取10mL四氢呋喃和1mL新配制的质量分数为10%的碘化钾溶液，混合1min后，不出现黄色（四氢呋喃氧化形成的过氧化物颜色）即可使用。(www.xing528.com)
与水不混溶的溶剂（如氯仿）中的微量极性杂质（如乙醇）以及卤代烃（CH2Cl2）中的HCl杂质可以用水萃取除去，然后再用无水硫酸钙干燥。
正相色谱中使用的亲油性有机溶剂通常都含有50～2000μg/mL的水。水是极性最强的溶剂，特别是对吸附色谱来说，即使很微量的水也会因其强烈的吸附而占领固定相中很多吸附活性点，致使固定相性能下降。通常可用分子筛床干燥除去微量水。
卤代溶剂与干燥的饱和烃混合后性质比较稳定，但卤代溶剂（氯仿、四氯化碳）与醚类溶剂（乙醚、四氢呋喃）混合后会产生化学反应，生成的产物对不锈钢有腐蚀作用，有的卤代溶剂（如二氯甲烷）与一些反应活性较强的溶剂（如乙腈）混合放置后会析出结晶。因此，应尽可能避免使用卤代溶剂，万不得已时应现用现配。
（2）流动相脱气 流动相溶液往往会因为溶有氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会引起检测信号的突然变化，并在色谱图上出现尖锐的噪声峰。小气泡慢慢聚集后还会变成大气泡，当其进入流路中时，会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱中，再想排出这些气泡就很费时间。溶解氧常和一些溶剂结合生成有紫外吸收的化合物。当使用荧光检测时，溶解氧还会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化降解或使溶液pH值变化。
纯溶剂中的溶解气体比较容易脱除，而水溶液中的溶解气体就比较难脱除。目前，液相色谱流动相脱气方法中使用较多的是超声波振荡脱气、惰性气体鼓泡吹扫脱气以及在线（真空）脱气装置脱气。超声波振荡脱气比较简单，基本上能满足日常分析的要求，是目前用得最多的脱气方法。惰性气体（通常用He）鼓泡吹扫脱气方法的效果最好。
（3）过滤 为了防止不溶物堵塞流路和色谱柱入口处的微孔垫片，液相色谱用的流动相溶剂在使用之前必须经0.45μm（或0.22μm）的微孔滤膜过滤，以除去杂质微粒。色谱纯试剂也不例外。用滤膜过滤时，特别要注意分清有机相（脂溶性）滤膜和水相（水溶性）滤膜。对于混合流动相，可在混合前分别过滤，若需混合后过滤，首选有机相滤膜。
（4）洗脱 高效液相色谱法有等强度洗脱和梯度洗脱两种方式。等强度洗脱是指在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适于分析组分数目较少、性质差别不大的样品。梯度洗脱是指在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常常会引起基线漂移和降低重现性。
梯度洗脱有两种实现方式：低压梯度（外梯度）和高压梯度（内梯度）。
两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多种洗脱曲线：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯度。线性梯度最常用，尤其适于在反相柱上进行梯度洗脱。
在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视。
1）要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定比例内能够混溶，超出范围后就不互溶，使用时更要注意。当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其在使用磷酸盐时需特别小心。
2）梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。在进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，这是因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡。
3）混合溶剂的黏度常随着组成的变化而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。例如，甲醇和水的黏度都较小，当二者以相近的比例混合时黏度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两倍。因此，要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。
4）每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态。需让10～30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。
（5）色谱柱的评价 一支色谱柱的好坏必须用一定的指标进行评价，包括色谱柱长度、内径、填充载体的种类、粒度、色谱柱的柱效能、不对称度和柱压降等。评价液相色谱柱的仪器系统有相当高的要求：液相色谱仪器系统的死体积应该尽可能小，这包括进样阀、连接管和检测器的池体积等因素；采用的样品及操作条件应当合理，在此合理的条件下，评价色谱柱的样品可以完全分离并有适当的保留时间。
（6）流动相的选择 流动相的选择与分离方式有关。下面介绍两种较为常用的液相色谱流动相。
1）吸附色谱流动相。吸附色谱中用得最多的流动相是非极性烃类，如己烷、庚烷等。有时为了调整流动相的极性，另需加入一些极性的溶剂，如二氯甲烷、甲醇等。因此，极性越大的组分此时保留时间也就自然相对越长。选择流动相的依据是溶剂强度或极性参数。
在吸附色谱中广泛使用混合溶剂作流动相。不同强度的溶剂按不同比例混合即可得到所需的溶剂强度。流动相溶剂组成上的某些改变会显著影响分离，即使使用与某单一溶剂有相同强度的混合溶剂，也有可能得到差异很大的保留值。
吸附色谱所用固定相（硅胶或氧化铝）具有非常不均一的表面能，即使有极微量的水或其他极性分子吸附在表面上，也会使吸附剂活性大大降低，从而使容量因子明显降低，使分离效果变差。同时，含水量的微小变化也会导致容量因子的变化，从而难以获得较好的重现性。失活或不可逆污染后的吸附柱可以按下列溶剂顺序各冲洗10～15min：二氯甲烷→甲醇→水→甲醇→干燥二氯甲烷→干燥己烷。
如果流动相是含大量水的极性溶剂，则硅胶会因吸附水而呈现一种动态离子交换的功能，可用来分离某些极性化合物。不过，此时的分离机理已不是吸附作用。
2）反相分配色谱流动相。反相分配色谱所用流动相是黏度小、沸点适中、性质稳定、对紫外光产生的背景吸收小、对样品溶解范围宽的极性水以及与水可互溶的有机溶剂或它们的混合物。后者使用得更多一些。
值得注意的是，水和有机溶剂混合之后的黏度与两者的配比并非成线性的函数关系，并且混合物的黏度总是高于纯溶剂的黏度，在某一配比时达最大值。黏度的增加将使柱压增高，溶质的扩散阻力增大，从而降低柱效能。
流动相溶剂的表面张力、介电常数对分离也会产生显著的影响。在常用的溶剂中，水是最弱的洗脱剂，这是由于其表面张力最大。增加水中有机溶剂的比例，会使表面张力减小，溶剂强度增加，洗脱能力增强，从而使溶质的保留值减小。若在水中加入无机盐，则会使表面张力增大，溶剂强度减小，洗脱能力减弱，从而使溶质的保留值增加。
通常的分离情况是要求流动相的溶剂强度大于水而小于纯溶剂。显然，将水与有机溶剂按不同的比例混合，就可获得适合于不同类型样品分析的流动相溶剂。为了获得最佳的分离效果，常采用的是三元及以上的混合流动相。不过考虑到流动相的黏度及其对紫外光产生的背景吸收等因素，反相色谱中最具代表性的混合流动相溶剂系统是甲醇-水、乙腈-水、四氢呋喃-水。
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