蛋白质提取和电泳分析方法应用于活性污泥研究

一、实验目的

了解双向电泳的原理；了解蛋白质双向电泳的实验流程；学习并掌握蛋白双向电泳的实验操作。

二、实验原理

蛋白双向电泳（Two-dimensional electrophoresis，2-DE）是等电聚焦电泳和十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（Soduim dodecyl sulfate SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）的组合，即先进行等电聚焦电泳，此时蛋白质按其等电点分离，然后再进行SDSPAGE，这种条件下蛋白质按分子量大小分离，染色后得到二维分布的蛋白质图。最后将图像扫描成像后可以借助软件分析，进行各实验组间的比较。蛋白质双向电泳是将蛋白质等电点和分子量两种性质结合起来进行蛋白质分离的技术，具有较高的分辨率和灵敏度，是分析和检测蛋白质的强有力手段。蛋白双向电泳实验主要分为三个阶段。

1.蛋白质提取及样品制备（Sample preparation）

蛋白质的有效提取是双向电泳分析的基础。细胞外溶解性蛋白质可以直接分离，而细胞内的蛋白质的提取则需要通过物理、化学或酶法破碎细胞，用适当的溶剂（如水、稀盐、稀酸、稀碱或缓冲溶液等）使蛋白质溶解，再通过离心去除细胞碎片等杂质，即获得蛋白粗提液。蛋白质粗提液中除含有蛋白质外，还含有多糖类、核酸等杂质，需要进一步提纯。蛋白质的提纯方法很多，如沉淀法或核酸酶消化法去除核酸、盐析法或沉淀法纯化蛋白质等。

样品制备要达到的目标是尽可能使样品中非共价键结合的蛋白质复合物解聚，扩大蛋白质溶解度，去除盐、脂类、多糖和核酸等可能干扰物，保证蛋白质在等电聚焦过程中继续保持溶解状态，以提高2-DE分辨率。蛋白质样品制备的影响因素包括蛋白质的溶解性、分子量、电荷数及等电点等。用于样品处理的缓冲液建议在低离子强度的基础上，既能保持蛋白质的天然电荷，又能维持其溶解性。可以利用离液剂（如尿素、硫脲），去垢剂（SDS、Chaps、SB3-10等），两性电解质，还原剂（DTT、TBP）等化合物促使样品中的蛋白质溶解；也可以借助不同溶解能力的缓冲液对溶解度不同的蛋白进行分别处理，从而降低样品的复杂性。

2.第一向等电聚焦（Isoelectric Focusing，IEF）电泳

等电聚焦电泳是一种特殊的聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶中加入两性电解质，从而使凝胶在电场中形成连续的pH 梯度。蛋白质是两性电解质，在不同的pH 环境中可以带正电荷、负电荷或不带电荷。对每个蛋白质来说都有一个特定的pH 值，在这个pH 值条件下，蛋白质的净电荷为零，在电场中不发生移动，这个特定的pH 值就称为该蛋白的等电点。蛋白质的等电点pH 通常在3～12，绝大多数pH 在4～7。对于某个蛋白质而言，当溶液pH值小于它的等电点时，该蛋白带正电荷；当溶液pH 值大于它的等电点时，该蛋白带负电荷；溶液pH 值等于它的等电点时，该蛋白不带电荷。等电聚焦电泳在特定pH 值范围的预制胶条上进行，含有各种不同等电点的蛋白质混合样品在电场的作用下，各蛋白质分子向与其所带电荷相反的电极方向移动，其可能得到或失去电子，随着移动的进行，蛋白质所带的电荷和迁移速率下降。当蛋白质迁移至其等电点pH 位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。蛋白质最终被聚焦在其等电点附近一个很窄的pH 梯度凝胶区域内。胶条的pH范围、长短及所加的电场强度都会对等电聚焦结果产生影响。根据所需要电泳的蛋白质性质选择合适pH 范围的胶条，一般选用pH 范围窄的胶条，施加高电压可得到较好的聚焦效果。常用胶条长度有7cm、11cm、17cm、18cm、24cm 等规格，小尺寸胶条电泳时间短，可用于优化样品制备等预实验，而大尺寸胶条电泳时间长，用于对复杂样品进行更为彻底的分析并鉴别出实验需要的蛋白。

3.第二向十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶是由单丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺在引发剂过硫酸铵（APS）和催化剂四甲基乙二胺（TEMED）作用下，聚合交联形成具有三维网状结构的凝胶。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所导致的不同迁移率将蛋白质分离成若干条带，如果蛋白样品中只含有一种蛋白质，电泳后就只有一个条带。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，作为变性剂和助溶剂，它能使蛋白质的氢键和疏水键断裂，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级结构和三级结构。在蛋白质中加入过量还原性的二硫苏糖醇（DTT），多聚体内的二硫键被还原成巯基，使得蛋白质分子解聚成多肽链。解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成蛋白质-SDS复合物，该复合物携带的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，从而消除了各种蛋白质分子间天然的电荷差异。所以，各种蛋白质-SDS复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，只取决于蛋白质或亚基的分子量大小。当蛋白质的分子量在15～200KD 时，电泳的迁移率与分子量的对数呈线性关系。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称SDS-PAGE。

PAGE凝胶根据胶浓度和缓冲液pH 值的不同分为浓缩胶和分离胶，蛋白质样品在浓缩胶中移动速度快，在分离胶中移动速度慢，在快慢交替界面蛋白质被压缩成一薄层，有利于提高电泳的分辨率。第二向电泳时只要配制分离胶，然后将聚焦好的蛋白胶条用低熔点琼脂糖封到分离胶上即可。

三、实验条件

1.仪器设备

超声破碎仪，高速离心机，台式高速冷冻离心机，Bio Rad双向电泳系统，扫描仪，单道可调微量移液器，水平摇床，Tip头，离心管等。

2.试剂与样品

（1）提取缓冲液：7mol／L尿素，2mol／L硫脲，4%（w／v）3-［（3-胆固醇氨丙基）二甲基氨基］-1-丙磺酸（CHAPS），10mmol／L 4-（2-氨乙基）苯磺酰氟盐酸盐三（羟甲基）氨基甲烷缓冲液（Tris-HCl），1mmol／L乙二胺四乙酸（EDTA），50mmol／L DTT，25mmol／L 4-（2-氨乙基）苯磺酰氟盐酸盐（PefablocSC），2mmol／L 4-（2-氨乙基）苯磺酰氟稳定剂（Pefabloc protector）。

（2）丙酮，80%丙酮，100%三氯乙酸（TCA）：500g TCA 溶于100mL水。

（3）水化上样缓冲液：7mol／L尿素，2mol／L 硫脲，2% CHAPS，0.001%溴酚蓝，定容后分装为500μL每管，于-20℃保存。使用时加入65mmol／L DTT，0.2%（w／v）Bio-Lyte两性电解质。

（4）胶条平衡缓冲液

①胶条平衡缓冲液母液：6mol／L尿素，2%SDS，0.375mol／L Tris pH=8.8，20%甘油，于-20℃保存；

②胶条平衡缓冲液Ⅰ：胶条平衡缓冲液母液10mL，0.2g DTT；

③胶条平衡缓冲液Ⅱ：胶条平衡缓冲液母液10mL，0.25g碘乙酰胺。

（5）低熔点琼脂糖封胶液：0.5%低熔点琼脂糖，25mmol／L Tris，192mmol／L 甘氨酸，0.1%SDS，0.001%溴酚蓝，加热溶解至澄清，室温保存。

（6）PAGE 凝胶制备试剂：ddH2O，30%丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺（Acrylamide-Bisacrylamide，Acr-Bis）（29∶1），1.5mol／L Tris pH 值8.8，1mol／L Tris pH 值6.8，10%SDS，10%过硫酸铵（APS），四甲基乙二胺（TEMED）。

（7）5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：125mmol／L Tris，1.25mol／L 甘氨酸，0.1% （m／v）SDS，pH=8.3。

（8）考马斯亮蓝染色液：将0.25g考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）R-250溶解在90mL甲醇∶水（1∶1，v／v）和10mL冰乙酸中，用滤纸过滤，室温保存备用。

（9）脱色液：90mL甲醇∶水（1∶1，v／v）和10mL冰醋酸的混合液。

四、实验步骤

1.活性污泥蛋白质的提取及制备

取活性污泥100 mL，4 500r／min 离心20 min 收集沉淀，重新悬浮于50 mL 0.9%NaCl溶液中以洗去多糖类杂质，4 500r／min离心20min，去上清液。沉淀重悬于50mL 50mmol／L Tris-HCl（pH=7）缓冲液，4 500r／min离心20min，去上清液。沉淀重悬于10mL提取缓冲液中，充分混匀，置冰上2h，其间每隔15min颠倒混匀一次。

超声破碎细胞，13 000r／min离心30min，上清液转移到一个干净的管子中，加入1／10体积的100%三氯乙酸和0.2% DTT 沉淀蛋白质，冰上放置30 min，13 000r／min 离心15min，去上清液，沉淀用80%丙酮和100%丙酮分别洗涤三遍，沉淀置冰上干燥2～3h，加400μL 提取缓冲液溶解蛋白质，加入20 U 核酸酶，37℃孵育30 min 去除核酸污染，13 000r／min离心30min，上清液转移至干净的离心管中，测定蛋白质的浓度，4℃短期保存或液氮速冻后-80℃保存备用。

2.第一向等电聚焦电泳

（1）取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液一管（500μL／管），置室温溶解。

（2）在小管中加入0.005g DTT，Bio-Lyte 4～6、5～7各2.5μL，充分混匀。

（3）从小管中移出400μL水化上样缓冲液，加入100μL样品，充分混匀。

（4）取-20℃冷冻保存的IPG 预制胶条（本实验中以7cm pH=4～7为例），室温中放置10min。

（5）沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘从左到右线性加入第（3）步的样品溶液150 μL。在槽两端各留1cm 左右，不要加样，中间的样品液一定要连续均匀（不要产生气泡，否则影响胶条中蛋白质的分布）。

（6）将所有的蛋白质样品加入聚焦盘中，然后用镊子轻轻地去除预制IPG 胶条上的保护层。

（7）分清胶条的正负极，轻轻地将IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应聚焦盘的正极，确保胶条与电极紧密接触（不要使样品溶液沾染到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不要使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶出）。

（8）在每根胶条上涂覆1mL 矿物油，缓慢地沿着胶条使矿物油一滴一滴加在塑料支撑膜上，防止胶条水化过程中液体的蒸发。(www.xing528.com)

（9）对好正、负极，盖上盖子。接通电源，设置等电聚焦程序，胶条先在20℃50V 条件下水化12～16h后进入等电聚焦阶段，按表7-9设置等电聚焦程序。

表7-9　等电聚焦程序

设置好上述参数后，选择所放置的胶条数，设置胶条的极限电流50μA／根，设置等电聚焦时的温度为20℃。

（10）聚焦结束的胶条，应立即进行平衡和第二向SDS-PAGE。如有特殊原因不能立即进行，可将胶条连同样品水化盘一起置于-80℃保存。

3.第二向SDS-PAGE

（1）配制12%的聚丙烯酰胺凝胶两块。根据胶条大小选择电泳槽，如7cm 胶条用Mini Protean 4电泳槽，而11～18cm 胶条都要用Protean ⅡXL 电泳槽，按表7-10配制12%的聚丙烯酰胺凝胶，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm 的空间，用MilliQ 水、乙醇或水饱和正丁醇封住胶面，保持胶面平整，聚合反应30min。待凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合完成。

表7-10　第二向SDS-PAGE分离胶的配方

（2）待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ 水、乙醇或水饱和正丁醇，蒸馏水冲洗胶面两次，再用电泳缓冲液冲洗一次。

（3）聚焦好的胶条胶面朝上放置于干的厚滤纸上，另取干的厚滤纸用超纯水（MilliQ水）浸湿，挤去多余水分，直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品（操作要轻柔，避免损坏凝胶表面），这样可以减少凝胶染色时纵条纹的出现（如果是从-80℃冰箱中取出的胶条，要先室温放置10min解冻）。

（4）将聚焦好的胶条取出，支撑面朝下胶面朝上放入一个干净的水化槽中，每个槽1根胶条，加入平衡缓冲液I，置水平摇床缓慢摇晃15min。

（5）将步骤（4）平衡好的胶条取出在电泳缓冲液中轻轻几下去除残留的平衡缓冲液Ⅰ，支撑面朝下胶面朝上放入一个干净的水化槽中，加入平衡缓冲液Ⅱ，置水平摇床缓慢摇晃15min。

（6）用滤纸吸去聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。

（7）将低熔点琼脂糖封胶液加热溶解。

（8）将5×电泳缓冲液稀释5倍成1×电泳缓冲液，赶去缓冲液表面的气泡。

（9）第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液Ⅱ，并用滤纸吸收多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。

（10）将IPG 胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸没在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。

（11）将放有胶条的聚丙烯酰胺凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。

（12）用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。

（13）放置5min，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固，将凝胶转移至电泳槽中。

（14）在电泳槽中加入1×电泳缓冲液，接通电源，起始时用低电流（5mA／gel／7cm）或低电压，待样品完全走出IPG 胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）（15～20mA／gel／7cm），待溴酚蓝指示剂到达凝胶底部边缘时即可停止电泳。

（15）电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面），去离子水洗涤10min。

（16）凝胶置于考马斯亮蓝染色液中，水平摇床轻轻摇晃过夜，然后用脱色液脱色3～4次，每次1h，直至背景色较浅为止。

（17）图像扫描并分析。

小心地将凝胶转移到扫描仪的玻璃板上，避免产生气泡和水痕，设置300dpi的分辨率扫描，得到的图像用专业软件进行分析。

（18）切割感兴趣的蛋白质点进行质谱分析或氨基酸末端测序。

五、实验结果与数据分析

1.详细记录实验时间与实验步骤

2.参考结果图（图7-11）

图7-11　蛋白质双向电泳图

六、问题与讨论

1.什么是蛋白质双向电泳技术？第一向和第二向电泳分别是根据什么原理分离蛋白质的？

2.从第一向转入第二向电泳时为什么一定要进行凝胶平衡？是不是平衡的时间越长越好？

七、注意事项

1.样品制备是实验能否成功的关键，结果图中出现的很多问题可能都是样品制备不当造成的，如尿素不纯可能会导致图片出现很多蛋白斑点串；盐离子浓度过高，尿素、DTT 或去污剂浓度过低，样品中含有不溶性蛋白质等都会导致图片横纹严重；样品制备错误导致图片上基本没有蛋白质斑点等。但是对于不同的样品，没有固定可行的蛋白质制备方法，要根据样品性质和文献报道的方法来进行优化，找到合适可行的蛋白质制备方法。

2.过硫酸铵易失效，制胶时如果用了失效的过硫酸铵，会出现胶溶液难以凝固的现象。一般过硫酸铵固体要置于4℃保存，过硫酸铵溶液最好现配现用，4℃保存的过硫酸铵液体建议2周内用完，否则弃之。

3.BioRad的等电聚焦盘有个盖子，为了固定胶条，这个盖子上设计了对应的突起，以便压住胶条。由于虹吸作用，矿物油会通过这个突起汇到相邻的空水化槽中，从而降低有胶条的水化槽中的矿物油液面。若胶条暴露在空气中，很可能会使等电聚焦失败。为了防止上述情况的发生，可以在相邻的空水化槽里，也加入适量（约80%）的矿物油。

4.蛋白质的上样量对实验结果影响也很大，上样量过小可能出现蛋白质点少，上样量过大又可能出现横纹。胶条大小不同上样量不同，染色方法不同上样量也不同，例如17cm的胶条，银染的话一般上样量为150μg蛋白质，而考马斯亮蓝染色的话，上样量则需达到500～1 000μg。不同的样品，上样量不同，含蛋白质种类多的样品，上样量应适当多一些，这样每个点才能有足够的蛋白质供检测。不同的实验目的，上样量也不同，如为了得到整张清晰的蛋白质图片，上样量以各个蛋白质点均清晰可见，且无横纹为宜；如为了鉴定差异性蛋白质点，则只要差异蛋白质点清晰且有足够蛋白质可供后续分析即可。