8.1.4 糖类的分离纯化方法
1.利用溶解度不同的分离方法
利用溶解度不同进行分离最常见的方法是水提醇沉法，该方法是常用的多糖提取分离工艺，利用多糖溶于水而不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂的特点进行分离。从不同的原料中提取，提取前先将原料进行脱脂和脱色处理，然后用水进行提取，提取液浓缩后即加入等体积或数倍体积的乙醇或丙酮溶液，不断搅拌，析出沉淀，离心，干燥得到粗多糖。该工艺对设备要求不高，但是工艺操作繁琐、劳动强度大、生产效率低，不适宜连续生产。
另一种利用溶解度的不同进行分离的方法就是分步沉淀法，是根据不同的多糖在低级醇或酮（通常是乙醇或丙酮）中具有不同溶解度而进行分离。大多数糖类可溶于水，三糖以下的寡糖还可溶于乙醇，但是随着聚合度的增大，相对分子质量的增加，在乙醇（或丙酮）中的溶解度逐步下降，因此逐步加大乙醇（或丙酮）的浓度可将不同相对分子质量的多糖分别沉淀出来。具体操作过程是：多糖混合物溶液在不断搅拌下缓缓加入乙醇，使乙醇的最终浓度为25%，然后静置1小时，离心，得到上清液和沉淀，该沉淀即为相对分子质量最大的多糖。上清液继续在搅拌下分次加入乙醇，使乙醇浓度逐渐增加至35%、50%、70%，同上操作，分别取出在每个醇浓度下所析出的沉淀。分步沉淀的关键是尽量避免共沉淀发生，因此在分离过程中应避免多糖混合物的浓度过高、乙醇加入速度过快，并且将溶液pH调至中性，从而保证多糖的稳定性。应该说多糖浓度越小，共沉淀作用越小，分离效果也越好；但若多糖浓度太稀，会导致多糖的回收率降低，乙醇消耗量过大；通常将多糖混合物的浓度控制在0.25%～3%。
2.利用电离性质不同的分离方法
多糖分子中的羟基为可电离基团，不同羟基的p K a值有微小差别。各种多糖中的羟基数量存在差别，这些差别成为多糖分离的重要依据。常用的分离方法有季铵盐沉淀法和金属络合法。
（1）季铵盐沉淀法：是一种较经典的方法，至今在多糖的纯化中仍在使用，如采用此方法纯化香菇多糖。季铵盐沉淀主要根据长链季铵盐能与酸性多糖或长链高相对分子质量多糖形成络合物，在低离子强度的水溶液中不解离形成沉淀析出，然后增加溶液的离子强度到一定范围，络合物则逐渐解离，最终溶解。这种方法常用于分离酸性多糖及中性高相对分子质量多糖。
常用的季铵盐有十六烷基三甲基铵盐（CTA盐）及其碱和十六烷基吡啶盐（CP盐）。操作时首先向多糖溶液中加入十六烷基三甲基铵溴化物（CTAB）等季铵盐沉淀剂，使其与酸性多糖形成沉淀，从水溶液中析出，此时可以通过调节溶液pH值增大中性多糖羟基的电离度，使之与季铵盐形成沉淀或者利用硼酸络合物使中性多糖沉淀下来。因此在加入季铵盐沉淀剂的同时，通过调节多糖溶液的pH值，就可以使电离度有微弱差别的多糖分别在酸性、中性、弱碱性、强碱性溶液中分步沉淀下来，从而达到分离的目的。在沉淀过程中加入少量（0. 02mol/L）硫酸钠具有促进沉淀聚集的作用。
通过加入季铵盐获得多糖沉淀之后，根据多糖的性质，使多糖从沉淀中游离出来的方法主要为：将沉淀物溶解于3～4mol/L的NaCl或KCl溶液中，说明该多糖已经转化成为钠盐或钾盐，然后直接加入3～5倍的乙醇使多糖沉淀下来，而季铵氯化物则留在溶液中；也可在3～4mol/L的NaCl溶液中加入碘化物或硫氰酸盐使季铵盐沉淀出来，而多糖留在溶液中；也可用正丁醇、戊醇或三氯甲烷等有机溶剂萃取季铵阳离子，溶液再经过透析去盐、冷冻干燥等最终得到多糖，成为钠盐的多糖可用盐酸处理，使其恢复游离糖。
将酸性多糖分离后余下的中性多糖，可通过逐渐改变pH或加入硼酸缓冲液的方法使其沉淀，从而得到分离。但是中性多糖与硼酸形成络合物的难易程度与溶液的pH和二元醇的立体位置密切相关。如有顺邻二羟基的酵母和橡树中的甘露聚糖（顺C2，C3羟基）可在pH＜8. 5时沉淀，如果改变pH值则不得进行络合反应，无法进行分离。
（2）金属络合法：根据不同多糖所含有的羟基及羧基的数目、位置及立体结构的不同，使其与各种铜、钡、钙和铅离子形成络合物的难易程度不同，而达到分离纯化多糖的目的。在多糖的纯化中最常用的是铜盐络合法及氢氧化钡络合法。
1）铜盐络合法：常用的铜盐络合剂有CuSO4、CuCl2、Cu（Ac）2溶液或费林试剂等。通常情况下这些试剂需过量使用以利于多糖的络合沉淀，但费林试剂不能过量，否则产生的沉淀会重新溶解。将得到的沉淀用水洗涤，然后用5% HCl（W/V）的乙醇液分解此络合物，再用乙醇洗去多余的铜盐。
2）氢氧化钡络合法：常将饱和Ba（OH）2溶液加到多糖溶液中。实验证明，当Ba（OH）2浓度小于0. 03mol/L时，葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和其他甘露聚糖可全部沉淀；当Ba（OH）2浓度小于0. 15mol/L时，4-O-甲基葡萄糖醛酸木聚糖可以沉淀下来，部分乙酰化后的木聚糖不能立即沉淀，在去除乙酰基以后即可沉淀，阿拉伯聚糖和半乳聚糖在任何浓度的Ba（OH）2溶液中都不沉淀，而水溶性多糖水溶液中加入饱和Ba（OH）2溶液即可产生多糖沉淀，藉此分离这些多糖。然后沉淀用乙酸（2mol/L）分解，上清液加乙醇沉淀即得游离多糖。
3.柱色谱分离方法(www.xing528.com)
（1）活性炭柱色谱法：活性炭吸附量大、效率高，其柱色谱适宜分离低聚糖混合物。通常用活性炭和硅藻土的等量混合物进行柱色谱分离。硅藻土有利于增加色谱过程中洗脱液的流速，也可直接采用40～60目的颗粒状活性炭装柱。
装柱之前，应对活性炭进行预处理。一般选用0. 2mol/L柠檬酸缓冲溶液或乙酸溶液将活性炭中所含有的Fe2＋、Ca2＋冲洗干净，或者改用2～3mol/L的盐酸煮沸，再用去离子水反复洗至中性。一般情况下，先用去离子水洗脱无机盐、单糖等，继而用5%～7. 5%的稀醇洗出双糖，用10%的稀醇洗出聚合度较高的多糖。逐渐增加乙醇浓度，得到聚合度渐增的多糖。糖类在活性炭上的吸附力有如下渐增的顺序：L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、棉子糖、毛蕊糖等。活性炭的吸附容量不受糖液浓度或无机盐的影响，因此有利于糖类成分的分离。
（2）离子交换树脂色谱法：在柱色谱分离纯化多糖的应用中，离子交换柱色谱是常用方法之一，特别是对于体积较大的多糖溶液，大多数首先采用离子交换柱色谱进行分离。通过柱色谱，多糖溶液得到浓缩及初步纯化（有的多糖通过该步骤即可得到各种均一多糖组分）。常用的阴离子交换树脂（如Amberlite IR-400）经过NaOH处理后，可以选择性吸附还原糖，部分吸附蔗糖，完全不吸附糖醇和苷，可以采用10%的NaCl溶液进行洗脱。阳离子交换树脂可以用于酸性多糖和中性多糖的分离。离子交换柱色谱分离的缺点是洗脱溶剂消耗量大，树脂再生处理繁琐。
（3）凝胶色谱法：凝胶柱色谱是根据多糖分子的大小和形状的不同即按分子筛的原理进行分离的。通常在获得粗多糖后，先通过离子交换柱色谱、透析、干燥，溶解后再用凝胶柱色谱进一步分离。常用的凝胶主要有交联葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖凝胶（Sepharose）和聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gelP）三大类，以及进行性能改良的新一代凝胶，如Sephacryl、Superdex和Superose等。展开剂为各种浓度的盐溶液及缓冲液。
（4）纤维素和离子交换纤维素色谱法：色谱柱中的载体是纤维素。先用乙醇液将柱内纤维素平衡好，然后多糖混合物全部沉淀于惰性的纤维素上面。若用不同浓度的乙醇溶液（如80%，60%，40%，20%）梯度洗脱，则不同多糖就依次洗脱出来。先洗脱的是相对分子质量小的多糖，最终洗脱的是相对分子质量大的多糖。在洗脱过程中，由于各种多糖在柱上进行无数次的溶解和沉淀过程，最终将各种多糖彼此分离。这种方法实质上与分步沉淀法相反，可称为“分步溶解法”。其理论塔板数较高，所以流出液的纯度高，但缺点是流速慢，纯化周期长，特别是对于黏度较大的酸性多糖，流速则过慢。
为了更好地分离多糖类成分，将纤维素改性，使离子交换树脂和纤维素结合起来制成一系列离子交换纤维素，用于分离多糖，获得了很好的效果。至今应用最广泛的阳离子交换纤维素有CM-cellulose、P-cellulose、SE-cellulose；阴离子交换剂有二乙基氨基乙基纤维素（DEAEcellulose）、DEAE-琼脂糖（DEAE-sepharose）及DEAE-葡聚糖（DEAE-sephadex）三种，其中以DEAE-cellulose应用得最广泛。DEAE-cellulose具有开放性的骨架，多糖能自由进入载体中并进行迅速扩散。它有较大的表面积，对多糖的吸附量较离子交换树脂大许多。改性后的纤维素上的离子交换基团较少，对大分子的吸附较弱，用一定离子浓度的盐就可将其洗脱下来。阴离子交换柱色谱适用于分离各种酸性、中性多糖及黏多糖。在分离纯化多糖的同时，还可以达到脱色的目的，如弱碱性树脂DEAE-cellulose就具有吸附色素的作用。
4.超滤法
超滤法是一种膜分离技术，根据溶液中多糖分子的大小和形状不同，在一定压力下使其通过超滤膜达到分离效果。超滤膜只允许一定相对分子质量范围的多糖通过，因此超滤法实质上的分离原理也是一种分子筛作用。超滤膜分离多糖具有不损害活性、分离效率高、能耗低、设备简单、无污染等优点，适用于相对分子质量较大、且分布范围较宽，溶液黏度大且不稳定的多糖提取分离。超滤法的应用前提条件是必须了解所要分离多糖的相对分子质量大小，这样才能有效地选取中空纤维超滤柱截留值的大小。理论上认为超滤法可以长期连续使用并保持比较恒定的产量和分离效果，但是近年来有报道大多数超滤膜能吸附多糖，使其收率大大降低，并且导致流速减慢。因此，在选择此方法进行纯化时，应进行先期的实验加以确认。此外，天然药物提取物是复杂的混合体系，在超滤前，必须预处理以除去有机胶体、机械颗粒等杂质，以降低对膜的污染。
5.去除蛋白质的方法
药材原料中很大一部分组成就是蛋白质，在多糖的提取分离工艺中，脱除蛋白质是一步非常重要的工序。常用的方法有Sevage法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法。若多糖提取液中含有少量蛋白，则选用Sevage法去除；多糖中游离的蛋白质或者植物多糖中的蛋白质可以选用三氯乙酸法去除；微生物多糖中的蛋白质则用三氟三氯乙烷法去除。
（1）Sevage法：用三氯甲烷∶戊醇按照5∶1或者4∶1的比例配制成二元溶液与多糖溶液混合，剧烈振摇30分钟，蛋白质变性成胶状，离心后处于三氯甲烷层与水层之间，从而除去。为了达到更好地去除蛋白质的目的，加速蛋白质变性，将戊醇改成正丁醇，目前有使用三氯甲烷-正丁醇（5∶1）加入糖液中剧烈振摇以去除蛋白质。
（2）三氟三氯乙烷法：在多糖溶液中缓慢加入三氟三氯乙烷，比例为多糖溶液∶三氟三氯乙烷（1∶1），低温下不断搅拌10分钟，离心得到上层水相，继续用上述方法重复处理几次。此法效率高，但是溶剂沸点低，易挥发，不宜大量使用。
（3）三氯乙酸法：多糖溶液中滴加3%的三氯乙酸溶液，直至溶液不再继续变浑浊，在5～10℃放置过夜，离心达到去除蛋白质的目的。
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