表达产物的分离纯化方法优化

作为药物的目的蛋白必须达到相当的纯度才能使用，否则目的蛋白中的杂质可能会在体内发挥各种生物活性，导致严重的不良反应。

（一）蛋白质的性质与分离纯化策略

1.重组蛋白原料的性质　首先，通过重组表达获得的原料，不论是大肠杆菌的裂解液，还是细胞培养上清液，抑或是动物乳汁或植物种子，其中目的蛋白表达量都很低，最高的也只占总蛋白的50%，甚至有的不到总蛋白的10%，因此，初始原料中含量低是重组蛋白分离纯化面临的第一个问题。

其次，原料的组成非常复杂，不仅有蛋白质，还有多肽、氨基酸、核酸、多糖、纤维素等较大分子物质，另外还有各类细胞代谢产生的小分子，如各类电解质、有机小分子等。特别是大分子物质在目的蛋白分离纯化过程中，因其性质与蛋白质相近，常常难以通过比较高效简洁的方法分离开来。

再者，蛋白质，尤其是重组蛋白，稳定性很差。重组蛋白即使一级结构与天然蛋白完全一致，空间结构、修饰水平仍然和天然蛋白结构有一定程度的差异，所以更容易受到外界环境如pH、温度、离子、剪切力、表面张力、酶等因素的影响，出现聚合或降解等情况。所以，必须在蛋白分离纯化过程中维持好蛋白质的稳定性，尽量采用比较温和的条件和方法，在尽量短的时间内完成整个分离纯化过程。

最后，目的蛋白作为药物，分别针对不同的适应证，给药方式有差别，临床应用剂量有较大差别，因此各类蛋白药物的质量要求不一，如蛋白纯度、含量、缓冲液条件、辅料与保护剂等均不同，所以，必须选择不同的分离纯化技术以及各种技术的组合。

2.蛋白质的性质　蛋白质是由氨基酸组成的生物大分子物质，既具有氨基酸的性质，又具有生物大分子的独特性质。氨基酸因其分子两端的氨基与羧基基团，可以携带正电荷与负电荷，为两性电解质。作为氨基酸的聚合物，蛋白质也属于两性电解质。在某一pH溶液中，若蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，这时溶液的pH即为该蛋白质的等电点。

蛋白质颗粒表面一般会形成水化膜并带一定的电荷，可以帮助蛋白质在水溶液中稳定存在，因而蛋白质具有胶体性质。

在一些理化因素的作用下，蛋白质正常的天然构象发生改变，即变性。变性后的蛋白质容易发生沉淀。例如，加热会引起蛋白质变性，出现凝固现象，此时，即使将该蛋白质置于强酸或强碱的水溶液中，也不会出现溶解状态。

另外，蛋白质在相对分子质量、带电性质、氨基酸的组成与结构等各方面均有差异，在水溶液中呈现不同的性状。针对其理化性质的差异，可以相应采取不同方法将目的蛋白与背景溶液中的其他物质分离。

3.分离纯化的常用策略　蛋白质分离纯化常以生物化学的方法为主，也可以结合一些物理学技术、有机化学技术以达到分离纯化的目的。任何一种方法的采用，均需充分考虑目的蛋白与其他杂蛋白之间的主要特性差异，选择合适的分离技术，蛋白质的主要特性及分离因素如表2-6所示。

表2-6　蛋白质的主要特性及分离因素

对于细胞内表达的蛋白质，必须优先采取超声或者高压均质的技术对细胞进行破碎处理，使细胞内的目的蛋白释放到水溶液中。

根据蛋白质相对分子质量大小的差别，一般可以采用离心、过滤、盐析、沉淀、透析，以及分子筛层析（凝胶过滤）的方法进行分离纯化。

根据蛋白质的等电点，或蛋白质表面电荷的性质，以及蛋白质质荷比，可以采取离子交换层析、电泳、吸附、沉淀等方法分离。

根据蛋白质分子表面基团的亲水性或疏水性，可以采取萃取、疏水层析或反相层析技术予以分离。

根据蛋白质分子的溶解性，可以采取变性与复性、盐析、沉淀、吸附、结晶、透析等技术进行分离。

还可通过适当加温或降温的方法，让部分蛋白质变性，从而和其他蛋白质分离。

针对蛋白质的特异性，可以采用亲和层析技术将目的蛋白与配基结合，从而与其他杂质进行分离。

（二）蛋白质分离纯化的基本流程和基本要求

在上述列举的各类蛋白质分离纯化技术中，离心、过滤、盐析、沉淀、透析等大多是物理学技术，相对比较温和而简便，一般来说耗时较短，对蛋白质结构和性状影响较小，甚至没有影响，因此可以根据需要多次应用，作为主要分离技术中间的过渡。

层析、变性和复性、电泳、吸附等大部分是生化技术、有机化学技术或生物学技术，分离效率高，但是操作相对复杂，一般分离时间较长，对蛋白质的结构或性状相对影响较大。因此，这类技术在整个蛋白质分离过程中往往作为分离纯化的主要技术，尽量只使用一次。不同分离原理的层析技术可以先后使用，同一分离原理的层析技术不要重复使用。

一般情况下，重组蛋白不能靠单一的分离纯化技术达到最终要求，通常需要多种技术组合使用。具体针对哪种目的蛋白采取何种技术组合方式，需要对目的蛋白的性质、表达方式、在原料中的状态，以及原料中其他杂质的性质综合判断。一般原则：首先采取成本最低，可以将大部分杂质分离，对目的蛋白影响最小，最大限度缩小原料体积的技术方法；然后在主要分离纯化步骤中尽量采用过滤与层析等高效率的分离技术；特殊情况下，采用成本最高的限速技术（如凝胶过滤、亲和层析等）作为精细纯化最后步骤，达到蛋白原液的纯度要求。

根据国家药品监督管理局药品审评中心出台的有关指导原则，当临床单剂量蛋白用量为微克或纳克级别，或者采用原核细胞表达的目的蛋白时，一般蛋白纯度不得低于95.0%；当临床单剂量蛋白用量为毫克级别，或者采用真核细胞表达时，重组蛋白纯度不得低于98.0%；对于一些临床使用剂量特别大的产品，如重组人血清白蛋白，临床单剂量可达10 g水平，可能其纯度要求不得低于99.9999%；对于一些临床剂量或表达方法不能按照上述原则确定的蛋白品种，需要与国家药品监督管理局药品审评中心进行沟通，确定具体纯度标准。目前，对于重组蛋白纯度的检测方法要求两种以上，一般采用非还原型十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）。其中，HPLC技术要求以对目的蛋白纯度变化最敏感的色谱柱来检测。另外，考虑到蛋白药物有一定的效期，而蛋白质在存放效期内会出现一些纯度下降的情况。因此，需要考虑新分离纯化获得的蛋白纯度必须高于指导原则中的纯度要求，这样，才能保证有效期内的蛋白纯度不低于指导原则中的要求。

（三）常用蛋白分离纯化技术

常用的细胞破碎方法，如高速组织捣碎法、玻璃匀浆器匀浆、反复冻融法、化学试剂处理法等因效率低、破坏蛋白，一般不在重组蛋白表达细胞破碎中使用，而主要采用超声破碎与高压均质的技术方法。

1.超声破碎

超声波是在物理介质中的一种机械波，既是一种波动形式，也是一种能量形式。超声波对细胞的作用主要有机械效应、热效应和空化效应。机械效应是指超声波传播过程中介质出现压缩与伸张交替的压力变化，可能引起细胞损伤；热效应是指介质对超声波引起的分子振动产生摩擦力使部分能量转化为热能，引起细胞过热化；空化效应是指在超声作用下细胞内产生空泡，空泡的震动与破裂将产生机械剪切压力、振荡和瞬时高温高压，导致水蒸气热解离而产生OH自由基和H原子，它们引起的氧化还原反应可使细胞发生损伤和蛋白质降解。

当外源目的蛋白采取细胞内表达方式时，为获得目的蛋白，必须首先破碎细胞。一般胞内表达主要存在于原核细胞（如大肠杆菌），因此采用超声波细胞破碎仪使细胞急剧振荡，将细胞壁破碎，细胞内物质释放到细胞外缓冲液中。如前所述，胞内表达主要有包涵体表达与可溶性表达两种形式。包涵体以固体颗粒形式堆积于细胞间质中，蛋白颗粒相对比较稳定，可以采用高破碎率的条件，使细胞碎片足够小，获得较高的收率。可溶性蛋白具有正常的空间结构和生物活性，对剪切力和温度都比较敏感，不能采用过于剧烈的超声条件。

一般的超声破碎条件：细菌悬浮于裂解液，然后置于冰水浴中，设定超声波细胞破碎仪功率为200～400 W，超声1～10 s、间歇3～10 s，连续重复50～120次。根据细胞破碎情况来设定合适条件。一般裂解液采用加入少量的溶菌酶和Triton X-100的Tris-HCl、EDTA、NaCl混合溶液，也有采用加入溶菌酶和Triton X-100的PBS溶液。

超声破碎完全时，细菌裂解液从浑浊、黏稠变得透明、清澈、不粘连；也可以采用高速离心观察，没有明显的沉淀物；最可靠的方式为显微镜下观察。在超声破碎的过程中，注意超声波细胞破碎仪的探头要深入液面下5 mm或更深，防止出现无效操作；不要采用过高的功率或过长的时间，以防止出现温度过高致蛋白质变性；尽量少产生气泡，降低对蛋白质的剪切力。

单次超声破碎一般适用于体积不大于500 mL的细菌培养液，大量的细菌培养表达需要采用多次超声破碎来达到破碎细胞的目的。超声破碎细胞过程均在超声波细胞破碎仪上进行。

超声波细胞破碎仪的工作原理是将电能经换能器转换为声能，声能通过液体介质而产生大量密集的小气泡，小气泡迅速炸裂，产生机械剪切压力，从而实现破碎细胞等物质的作用。

超声波细胞破碎仪由钛合金超声探头、高能效换能器、微机控制器和隔音箱组成。其工作频率范围一般为20～25 kHz，具有定时和计数、循环或不循环等工作模式。一般可以用于破碎组织、细菌、病毒、孢子及其他细胞结构，使用过程中会产生大量的热和噪声，因此需要置于隔音箱中冰浴操作。

2.高压均质　所谓高压均质是指在超高压（最高可达60000 psi）作用下，使悬浊液状态的物料通过特殊结构的容腔（高压均质腔），物料因挤压发生结构与理化性质的改变，最终达到均质（也称为匀浆，变成微粒化、分散化、均匀化的悬浮液或乳化液）的目的。通常采用高压均质机来实现。

高压均质机亦可称为高压微射流纳米分散仪，主要由高压均质腔和增压机构构成。通过增压机构的高压（≥20000 psi），液料高速流过均质腔的狭窄缝隙，受到强大的剪切力；压力转化为动能，撞击到前方的金属壁而产生强大撞击力；静压力突降和突升而产生空穴爆炸力。这个过程使液料同时受到高速剪切、高频振荡、空穴爆炸和对流撞击等机械力作用，并产生相应的热效应，由此引发的引起物料大分子的物理、化学及结构性质发生变化，最终达到均质的效果。高压均质腔是核心部件，其内部的特殊几何结构是决定均质效果的主要因素；而增压机构为液料高速提供压力，压力的高低和稳定性在一定程度上影响产品的质量。

高压均质过程中，细菌可采用与超声破碎相同的细胞裂解液。整个过程中细胞悬液应置于冰水浴中，常常将细胞悬液通过金属盘管注入高压均质机，而金属盘管和高压均质机出料管都置入冰水浴以提高降温效率。需要采取显微镜检查细胞破碎效果来决定具体采取多少个循环均质过程。因高压均质机内腔管路较长，需要大量液料充实，否则均质效果不好，且无效腔中浪费过大。目前市场提供的最小型高压均质机一次性处理的液料量应不小于1 L细菌培养液。

注意不要混淆高压均质机与高剪切均质机，后者利用定转子之间的高速相对运动产生高剪切作用，并伴随较强的空穴作用对物料颗粒进行分散、细化、均质，适用于药物解聚、食料混匀、化妆品乳化、纤维材料粉碎等，但不适于细菌的破碎这类极细化的需要。另外，中压微射流微米分散机也不能满足细菌破碎的细化要求。

3.过滤与超滤　过滤（filtration）即利用介质滤除流体中的杂质。更具体的定义：在一定的推动力或其他外力作用下悬浮液（或悬浮有固体颗粒的气体）中的液体（或气体）透过介质，超过一定大小的固体颗粒和其他物质被过滤介质截留，从而使不同大小的固体及其他物质与液体（或气体）分离的操作。

根据截留物质颗粒大小，过滤一般分为过滤、微滤、超滤、纳滤和反渗透等。具体划分不同概念的过滤精度范围略有差别，一般过滤精度超过50μm，直接称作过滤；过滤精度为0.1～50 μm称作微滤；过滤精度为1～100 nm称作超滤；过滤精度为0.1～1 nm称作纳滤，过滤精度为0.1 nm以下，同时需要很高压力实现过滤的方式称作反渗透。一般情况下，对于过滤膜（半透膜），溶液中的溶质均从浓度高的一侧透膜进入浓度低的一侧，在极高压力（＞100 MPa）下，溶质可以从浓度低的一侧穿过膜进入浓度高的一侧，这个过程称为反渗透。

常用的过滤介质形态有滤膜、滤板、滤布、滤芯、滤柱等。常用介质材料主要有三大类：一种是天然或合成的高分子纤维，或者金属丝编织或加工而成的滤膜、滤布等；另一种是多孔性固体，如石英砂、陶瓷、金属粉、塑料粉等烧结或黏接而成的滤板、滤芯等；还有一种是各类堆积的颗粒物质，如活性炭、硅酸盐砂、砾石、硅藻土、玻璃棉等非整体材料，在一定形状容器里分层堆积形成，如滤柱等。每一类过滤介质根据实际用途可能采用单种或多种不同材质制作。滤器结构及其外观种类繁多，有一次性针头式过滤器、漏斗滤器、筒式滤器、平板式滤器、膜包滤器、中空纤维滤器等，还有很多工业用途滤器，这里就不一一列出。

一般分离固体不溶性颗粒，如未彻底破碎或完全消化的细胞碎片、聚合的大分子物质等，可以采用过滤；对于截留一些微生物，如细菌、真菌、螺旋体等，以及一些大分子胶体物质（相对分子质量大于50000），可以采用微滤，如常用的0.22μm、0.45μm除菌滤膜；对于分离不同相对分子质量的大分子物质（如蛋白质、胶体等），或者截留微生物（病毒、支原体、衣原体等），可以采用超滤；对于分离一些直链大分子（如多糖、色素、有机物等），或者部分脱盐，可以采用纳滤；对于更换蛋白溶液缓冲体系或者脱盐，采用反渗透膜及相关装置可达到目的。其中，微滤与超滤滤膜滤孔比例示意图如图2-12所示。

从宏观角度，滤膜可以看成一片滤膜上有很多小孔，孔壁是光滑平整的，其实放大后可以发现膜孔壁是凹凸不平的。微滤通常采用与膜介质平面垂直的压力，小分子物质将直接穿过介质上的微孔到介质的另一面，而较大分子的物质则被截留，达到分离效果。超滤时，膜孔径和滤膜厚度相近甚至小很多，膜孔实际变成了一条弯曲的管道。如果采用与膜介质平面垂直的压力，可能使部分与孔径尺寸大小相近的物质堵塞滤孔，各类物质积压在膜介质表面，导致过滤功能丧失。因此，常常采用切向（与膜介质平面平行）压力，让小分子物质在流过膜表面时自由穿过，其他大分子物质和没有穿过的小分子物质再次循环从介质表面流过，这样反复多次即可达到完全分离的效果。

为了提高超滤效果，增大超滤面积，常常将滤膜多层重叠，让混合液通过时向两侧同时滤过小分子。或者将超滤膜制成中空纤维管，混合液从管内流过，小分子物质通过管壁超滤到中空纤维间隙中，如图2-13所示。

图2-12　微滤与超滤滤膜滤孔比例示意图

图2-13　超滤滤膜包示意图

对于过滤精度比超滤更高的纳滤和反渗透，也采取与超滤同样的加压方式。而且随着过滤精度增高，施加的压力更大，对介质的垂直加压更容易造成介质的损坏。通常情况下，微滤时的膜压力为0.05～0.5 MPa，超滤的膜压力为0.1～0.7 MPa，纳滤的膜压力为0.3～0.7 MPa，反渗透的膜压力为1.4～10.5 MPa。

4.离心　离心是一种在生物医药领域用途很广的技术，主要用于蛋白质、核酸、细胞及其组分的分离。离心技术是利用物体高速旋转产生的离心力，根据分离物颗粒的大小、形状、密度、介质的黏度和转子速度，将颗粒从溶液中分离出来。

离心一般用于分离两种混溶物质，混合物中密度较大的组分向远离轴心方向移动，密度较小的组分向轴心方向移动。通过改变转速和溶液介质，可以增加离心管上的有效重力，更快更完全地使沉淀物（颗粒）聚集在离心管底部或外侧。剩下的溶液可以移弃或收集起来。采用离心技术分离的悬浮颗粒往往是指以悬浮状态存在于液体中的细胞、细胞组分、病毒和蛋白质、核酸等生物大分子等。离心技术是上述成分分离的常用方法之一，也是蛋白质分离纯化最常用的方法，尤其是超速冷冻离心技术。离心对大分子物质的结构、性质几乎不产生影响，操作时间较短，可以在分离纯化各种技术方法中作为过渡步骤多次使用。

常用的离心技术包括沉淀离心、差速离心、密度梯度离心、分析超速离心、离心淘洗、区带离心及连续流离心等技术，其中沉淀离心、差速离心和密度梯度离心是实验室常用的离心技术。其余技术均需要特殊的离心机或转头。

根据采用的离心技术不同，常用的离心机有多种类型，一般低速离心机的最高转速不超过6000 r/min，常用于细胞或细胞组分离心；高速离心机转速在20000 r/min以下，常用于蛋白质、核酸等大分子的离心；超速离心机的最高速度达25000 r/min以上，常用于病毒等分离纯化。大容量离心机，一般采用离心筒或吊篮来放置装有待分离样品的离心杯、离心瓶，最高一次分离溶液可达6 L；对于一些容量较小的台式离心机，常采用角转头，其中放置离心管，一次至少分离几百微升的样品。

然而，对于数百升乃至上千升培养体积的生物反应器，如果采用离心杯、离心瓶，可能会因操作烦琐、时间过长而导致重组蛋白的降解。往往采用连续流离心机，用于生物大分子分离的常见连续流离心机有筒式（管式）离心机、碟式离心机。它们是通过样品液流经离心管或离心腔时，高速旋转产生的加速度使悬浮的颗粒在其中呈梯度排列，在不同梯度层面的出口分别流出，实现分离。特别适合于相对分子质量相差较大的物质，如细胞或细胞组分与培养上清液的分离，如图2-14所示。

图2-14　连续流筒式离心机与碟式离心机分离基本原理图

采用合适的分离介质也会提高离心技术的分离效果。如离心机转子高速旋转时，当悬浮颗粒密度大于周围介质的密度时，颗粒向离开轴心的方向移动，发生沉降；当颗粒密度低于周围介质的密度时，则颗粒朝向轴心方向移动而发生漂浮。针对不同相对分子质量、不同结构的目的蛋白，可以选择合适的离心介质，如腺病毒采用CsCl超速离心分离技术。

5.盐析　在蛋白质水溶液中加入无机盐溶液，随着盐浓度的增大，蛋白质溶解度下降，逐渐沉淀下来，这个过程称为盐析（salting out）。蛋白质是亲水性大分子，在水溶液中有双电层结构，因此在水溶液中处于稳定溶解状态。当盐离子浓度较大时，离子对水分子的亲和力和电离作用影响蛋白质分子周围的水化膜，中和蛋白质表面的电荷，使蛋白质溶解度降低，于是发生蛋白质分子之间的聚集并沉淀。一般采用中性盐，如硫酸铵、氯化钠或硫酸钠等，蛋白质不会出现失活，当盐浓度下降时，蛋白质会重新溶解，所以盐析方法在蛋白质分离纯化、浓缩或储存时常被应用。

如果向蛋白质溶液中加入某些重金属盐，或者加入某些酸性盐、碱性盐，可能引起蛋白质化学性质的改变，出现蛋白质凝聚并从溶液中沉淀析出，难以复原，这种作用叫变性。

盐析时，注意蛋白质的浓度和中性盐溶液的浓度均对蛋白质沉淀效果有影响。当蛋白质浓度高时，只需要较低的盐饱和度即可引起蛋白质沉淀，会出现各类蛋白质共沉淀的现象，影响蛋白质的分离效果；当盐浓度（离子强度）较低时，溶解度较低、亲水性较差的蛋白质容易析出，如血清中球蛋白较白蛋白更容易沉淀析出；而盐浓度较高时，可以沉淀大部分蛋白质，所以采取不同饱和度盐溶液分段盐析，可以达到分离目的蛋白的目的。

在重组蛋白分离纯化过程中，盐析最常采用的中性盐是硫酸铵，不仅可以作为分离的手段，也常作为在分离纯化过程中蛋白质稳定保存过渡的一种方法。针对不同稳定性蛋白质，可在不同温度下使用盐析，稳定性较差的蛋白质需要在低温下盐析。盐析后蛋白质重新复溶可采用透析方法。

6.沉淀　使蛋白质沉淀的方法有盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀，以及其他沉淀等。

盐析方法如前所述。

等电点沉淀是指将蛋白质溶液的pH调整到其等电点，蛋白质溶解度下降出现沉淀的方法。通过不同蛋白质等电点不同的性质，可以采用分段pH调节方法，将不同蛋白质分离开来。

有机溶剂沉淀是指采用一些与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇、丙酮等），将其加入蛋白质水溶液中，水溶液的介电常数降低，增加了相反电荷基团之间的吸引力，从而促进蛋白质分子聚集并沉淀，此过程中，有机溶剂影响蛋白质分子表面的水化膜也是重要原因，这个方法称为有机溶剂沉淀法。注意常温下，有机溶剂易使蛋白质变性，故常采用低温沉淀法。

除以上最常用的沉淀方法外，在蛋白质溶液中加入一些生物碱沉淀剂（如苦味酸、鞣酸、钨酸等）或者某些酸（如三氯乙酸、磺酸、水杨酸、硝酸等），可与蛋白质结合生成沉淀，要使该沉淀能够复溶，需要控制浓度、温度条件。加入一些非离子型聚合物、聚电解质等，如聚乙二醇，可以帮助蛋白质沉淀。

加热或多价金属离子也可使蛋白质沉淀，但常常会引起变性，注意根据需要选择。

7.透析　透析袋是一种由半透膜制作的袋子，将需要分离的蛋白质溶液或沉淀置于透析袋中，然后将透析袋浸泡于透析液中（图2-15），透析袋内的小分子物质可通过被动扩散自透析袋进入透析外液，通过多次更换透析液，最后达到透析袋内外溶液离子强度基本平衡，这个过程或方法叫做透析。透析可以起到分离蛋白质、复溶蛋白质、浓缩蛋白质或脱盐等作用。

图2-15　透析示意图

当透析液的渗透压高于透析袋中的溶液时，透析袋中的水会渗出去，从而使蛋白质溶液体积减小达到浓缩蛋白质的作用。其他情况下，均采用比蛋白质溶液浓度低的溶液作为透析液，起到小分子杂质蛋白质渗出，蛋白质沉淀复溶、脱盐的作用。(www.xing528.com)

透析过程中，为保证蛋白质溶解环境不出现剧烈变化，一般尽量降低透析袋内外的离子强度差；对于不稳定蛋白质，尽量采用低温透析；为提高透析效率，要让透析液转动，同时固定透析袋，不要使透析袋随透析液旋转，提高透析液在透析袋表面更新的机会；为防止透析袋因溶剂大量渗入而破裂，透析袋容积应为透析袋中的蛋白质溶液体积的2～3倍。

8.吸附　蛋白质由氨基酸组成，因其具有两性电解质的性质，故当其处于pH不同的溶液中时，会带不同的电荷。蛋白质分子之间或与其他物质之间常因静电、氢键或疏水作用而出现吸附现象。当氢离子参与其中并与电负性强的原子静电吸引时，于是产生氢键。当两个极性基团之间，或极性基团与水分子之间发生静电吸引，引起非极性基团因避水而被迫接近，于是出现了疏水吸附作用。实际上，氢键与疏水作用本质都是静电作用，均属于非共价作用。

蛋白质的肽链常按照一定的有序结构形成不同的亲水区和疏水区，在和一些带有表面电荷的物质接触中，会产生非共价吸附作用，如表面活性剂、壳聚糖、硅藻土、磷脂包覆颗粒物质，或纤维素膜等均可以作为蛋白质吸附分离的介质。吸附作用强弱和吸附过程与蛋白质溶液的电离强度、pH有关；解除吸附作用可通过调节其溶液的离子强度和pH来实现。

除非共价作用吸附以外，蛋白质也可采用亲和吸附方式来分离，这个问题留待亲和层析部分来描述。

9.电泳　在外电场作用下，带电的颗粒向着与其电性相反的电极移动，这个现象称为电泳。电泳技术可用于氨基酸、多肽、蛋白质和核苷酸等生物分子的分析、分离和制备。蛋白质在非等电点的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。根据支撑物不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。大多数情况下，蛋白质带负电荷，从负极向正极移动。

薄膜电泳是将一片浸润了缓冲液的纤维素膜或滤纸水平铺在固体表面，两端接上电极，形成一个电场，将带电荷的生物大分子样品加在一端或中央，开始通电，进行电泳。凝胶电泳是用缓冲液配制成凝胶，或水平铺放在固体表面，或垂直夹在两块固体平面间，形成一个矩形凝胶区域，在其两端连接电极，在一端加上待分离样品，通电后可进行电泳。凝胶电泳最常用的介质材料为琼脂糖、聚丙烯酰胺。琼脂糖水平凝胶电泳一般用来分离DNA，聚丙烯酰胺凝胶电泳一般用来分离蛋白质。

聚丙烯酰胺凝胶电泳一般在凝胶与缓冲液中加入SDS，简称为SDS-PAGE（图2-16）。SDS与蛋白质结合可以解离蛋白质间氢键，消除蛋白质分子内疏水作用，SDS与蛋白质所形成的复合物带有的电荷远大于蛋白质原有的电荷，所以电泳过程中蛋白质移动的快慢主要与蛋白质相对分子质量有关。如果同时加入二硫苏糖醇（DTT）或β-巯基乙醇（β-ME），可以断裂蛋白质分子间的二硫键，蛋白质被还原成椭圆形单体，在SDS-PAGE中准确体现单体的相对分子质量大小，称为还原性SDS-PAGE。如果不加入DTT和β-ME，则称为非还原性SDSPAGE，可以保持一定的蛋白质空间结构，蛋白质电泳位置不仅与相对分子质量有关，还与蛋白质的多聚体结构有关。如果PAGE中不加SDS，则称为非变性PAGE，或天然PAGE，电泳过程中可以保持蛋白质的天然完整性，可以回收分离后的蛋白质。

PAGE凝胶一般由浓缩胶和分离胶两部分组成，其浓度、缓冲液组分和离子强度、pH，以及电场强度都不同，也被称为不连续凝胶电泳，目的是可以让分离样品在通过浓缩胶电泳后被压缩成一条浓缩带，有助于在分离胶中更好地将不同蛋白质分离成一条条聚集的条带，提高分离效果，便于分辨。所以，SDS-PAGE具有三种物理效应：一般电泳分离的电荷效应，样品的浓缩效应和凝胶对分离分子的筛选效应。

利用两性电解质，如两性元素氧化物的水合物、氨基酸等，或专用的商品试剂，加入PAGE凝胶中，在电场作用下，两性电解质使凝胶介质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，形成一个个很窄的条带，这个就称为等电聚焦电泳（isoelectric focusing electrophoresis，IFE）。如果多种等电点相近的蛋白质还不能很好地分离，将凝胶旋转90°，使电极调换到另两边，形成与原来电场方向垂直的外电场，成为一个SDS-PAGE，再次电泳，可以将蛋白质进一步分离开，这个过程称为双向电泳（图2-17）。

图2-16　SDS-PAGE结构原理示意图与电泳胶局部图

图2-17　双向电泳平面示意图

毛细管电泳是指一类以毛细管作为分离通道，其间充满缓冲液或填充凝胶介质，在高压直流电场作用下，生物大分子得以分离的技术。毛细管电泳包含电泳、色谱或其交叉的有关性质，可以极大地提高分离分析的精度。

毛细管常用材质为石英，内有特殊涂层，因毛细管形状、毛细管数量、缓冲液、凝胶的不同，可以实现多种不同目标的分离分析功能。于是出现诸如毛细管区带电泳、毛细管等速电泳、毛细管等电聚焦、毛细管凝胶电泳、陈列毛细管电泳、填充毛细管电色谱等数十种类型。可用于分离与分析氨基酸、多肽、蛋白质、DNA片段、核酸以及多种小分子，也可以用于手性化合物的分离。毛细管可以提高热散作用，减少了由于热效应引起的很多问题，如样品扩散对流，区带变宽等，因此不需要加入稳定介质即可进行自由流动电泳。

毛细管管壁上牢固结合的定域电荷，在轴向直流电场作用下可吸引溶液中的电荷分子与电泳方向反向迁移，形成电渗作用。电渗作用使溶液向负极流动，其速率比一般样品电泳速率大。因此所有的正、负离子和中性分子都一起朝一个方向产生差速迁移，在一次毛细管电泳中同时完成正、负离子的分离测定。由于电渗作用可以影响毛细管电泳的分离效率、分离度和选择性，因此，通过改变管壁内涂层性质，改变缓冲液的成分、浓度、pH，加入添加剂，调整管径、电场、温度等，都可以改变电渗作用，从而改变毛细管电泳的分离效果。

毛细管电泳采用毛细管电泳仪进行检测，被分离的分子接近负极，都将通过毛细管电泳仪的紫外检测器并传递信号到记录仪，所得结果是被分离组分的紫外吸收对时间的峰谱。

10.变性与复性　包涵体是原核细胞胞内表达蛋白凝集成高密度、不溶性的固体颗粒，其中50%以上为无生物活性的重组蛋白，其他为核糖体、核酸、外膜蛋白、脂多糖等原核细胞物质。通常一个细胞中只有一个包涵体，包涵体大小一般为0.2～1.5μm，密度为1.1～1.3 mg/mL，大小和密度与表达的重组蛋白、表达条件均有一定关系。

重组工程菌表达产率过高，表达产物累积，没有足够时间进行蛋白质折叠，蛋白质间产生非特异性结合而凝集成包涵体，这是最主要的原因。含硫氨基酸比例较高，发酵温度高，胞内pH接近蛋白质等电点，蛋白质本身的溶解度，蛋白质分子间的各种键能作用，以及细菌细胞内缺乏蛋白质折叠的各种酶类或辅助因子等物质，这些都是出现包涵体的重要因素。

为了使包涵体恢复成有生物活性的目的蛋白，最常用的方法就是蛋白质的变性与复性。

这里说的变性是指可以恢复的蛋白质变性，一般主要改变蛋白质的三级结构，尽量不改变其二级结构。常采用尿素、盐酸胍等变性剂，打断包涵体蛋白质分子间和分子内的各种作用力，使多肽舒展开。首先采用溶解于TE缓冲液的低浓度变性剂，或者去垢剂（如SDS、Triton X-100等）除去包涵体表面的膜蛋白、核酸等杂质碎片。然后采用较高浓度（6～8 mol/L）尿素或盐酸胍，或者其他去垢剂溶解包涵体。如果包涵体中的蛋白质形成链间二硫键或者链内非活性二硫键，还需要加入低浓度的β-ME或DTT等还原剂，增强溶解效果。

经过变性的蛋白质难以在胞外自动恢复成具有活性的蛋白质，因此必须采用合适的复性方法使目的蛋白从完全伸展状态恢复到正常的或天然的折叠结构，有的需要去还原剂重新形成正确的二硫键。通常的复性方法有稀释、透析、超滤、层析（疏水层析或凝胶过滤层析）、吸附等多种方法。当通过这些方法使变性剂浓度逐步降低，如尿素降至2 mol/L，盐酸胍降至1.5 mol/L时，蛋白质复性过程基本完成。较大规模的蛋白质复性一般采用超滤和层析方法，回收率高，速度快，易于放大到生产规模。

复性过程比较复杂，除个别蛋白质外，大部分蛋白质的复性效率很低，一般不超过30%。为提高复性效率，通常采用调整蛋白质浓度、复性温度、pH，以及加入L-Arg、Tris等低分子化合物，采用GSH/GSSG（谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫醚）、DTT/GSSG等氧化还原转换系统，加入折叠酶或分子伴侣，改用非离子型去垢剂或表面活性剂等方法。对于蛋白质复性的效果一般采用凝胶电泳（如非变性PAGE、非还原SDS-PAGE）、色谱法（离子交换、反向、毛细管电泳色谱等）、光谱学方法（紫外差光谱、荧光光谱、圆二色光谱等）、黏度或浊度法，以及生物活性检测、免疫学检测等方法来测定，其中生物活性检测、免疫学检测是蛋白质复性效果的最重要的检测。

11.层析与色谱　层析技术也称为色谱技术（chromatography technology），是指含混合物的流动相流经固定相，依据混合物中组分与固定相结合力的差别从而实现组分分离的技术。

1900年，意大利出生的植物学家Mikhail Tswett在俄罗斯利用色谱技术分离植物色素，该技术因叶绿素、胡萝卜素、叶黄素等带颜色的物质分离而得名。有趣的是俄文Tswett含有颜色的意思。Tswett提交与发表俄文论文的时间分别是1903年和1905年，因此，很多文献说他于1905年前后发明此技术。1952年，Martin和Synge因提出比较完整的色谱理论和方法，并推动色谱技术取得重大进步，从而获得当年的诺贝尔化学奖。

根据承载固定相支持物的结构，层析技术分为平面层析（纸层析、薄膜层析）和柱层析。用于蛋白质分离纯化的主要是柱层析，平面层析更多应用于样品分析。根据流动相的性质，主要有液相色谱和气相色谱。气相色谱主要用于微量样品的分析，而液相色谱主要用作样品的分离纯化。根据蛋白质分子的不同性质，常用的层析技术主要有吸附层析（也称为正相色谱）、反相层析、疏水层析、离子交换层析（阴离子交换层析、阳离子交换层析）、聚焦层析、凝胶过滤层析（也称为排阻色谱）、分配层析与亲和层析等。其中反相层析与分配层析常在流动相中加入各类有机溶剂，这些有机溶剂可能引起蛋白质样品的变性；而聚焦层析因其载荷不高，主要用于实验室蛋白质的分离。在蛋白质药物的分离纯化工艺中最常采用的是疏水层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析与吸附层析（表2-7）。

表2-7　主要层析类别及其作用

知识链接2-1

层析技术具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高和应用范围广等优点，是重组蛋白分离纯化的最常用技术。

（1）离子交换层析。

离子交换层析（ion-exchange chromatography，IEC）是利用各类分子的解离度、离子净电荷和表面电荷分布差异来进行分离的一种分离纯化生物大分子的技术方法，其固定相采用固体离子交换剂，依据流动相中各组分离子与固定相上的平衡离子产生可逆性交换时结合力大小差别来达到分离的目的。

离子交换剂由不溶于水的高分子聚合物基质（如纤维素、树脂、葡聚糖凝胶等）通过一定化学反应结合上电荷基团（强酸性、弱酸性、强碱性、弱碱性等）而形成，平衡离子是缓冲液中结合在电荷基团上并与电荷基团电性相反的离子，它可以和流动相中的其他离子基团发生可逆交换反应。当平衡离子带正电荷时，可以与正电荷离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂，这种层析称作阳离子交换层析；当平衡离子带负电荷时，可以与负电荷离子基团发生交换作用，称作阴离子交换剂，这种层析称作阴离子交换层析。在选择离子交换层析类别时，需要分离纯化的目的蛋白的等电点与固定相中的pH必须相差至少一个单位。

蛋白质作为两性电解质，随溶液pH不同带不同电荷。为防止pH过高或过低影响蛋白质的结构与活性，尽量采用中性缓冲液。当目的蛋白等电点pI在酸性范围内时，采用阴离子交换层析技术和pH大于目的蛋白等电点的缓冲液，目的蛋白带负电荷，被阴离子交换剂吸附，正电荷分子与中性分子不吸附，然后通过改变负电荷洗脱液的离子强度和pH依次洗脱解离度不同的蛋白质分子，达到分离目的。相反，当目的蛋白等电点在碱性范围内时，采用阳离子交换层析和pH小于目的蛋白的等电点的缓冲液，目的蛋白带正电荷，被阳离子交换剂吸附，负电荷分子与中性分子不吸附，然后采用不同离子强度、不同pH的正电荷洗脱液依次洗脱解离度不同的正电荷蛋白质分子，实现分离纯化蛋白的目的。

离子交换剂具有开放性支架、多孔性、亲水性和吸附力弱等特性，因此，离子交换层析具有吸附容量大、交换容量大、条件温和、回收率高的优点。然而正因为其根据电荷量和解离度差异的原理来分离，一些带电性接近的蛋白质分子的分离峰易出现重叠，分离纯度不高。基于其优缺点，离子交换层析往往用作蛋白质的初步纯化，可快速高效获得相对较高纯度的蛋白质样品，便于后续进一步纯化。

（2）疏水层析。

疏水层析（hydrophobic chromatography）又称疏水作用下层析（hydrophobic interaction chromatography，HIC），是基于蛋白质的疏水性质的差异，利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的疏水分子发生可逆性结合，从而实现蛋白质分离的技术。在高盐溶液中，疏水性较强的蛋白质形成很强的疏水键，并与疏水性配基结合，其他蛋白质流出或被洗涤掉，然后逐步降低洗脱液盐浓度，结合到疏水性配基上的蛋白质因疏水性强弱不同，被先后洗脱下来。从分离的作用机制来看，疏水层析属于吸附层析，并且与反相色谱（reversed phase chromatography）理论依据相同。

其由于上样时盐浓度高，可以用作盐析后的分离步骤。影响疏水层析的因素主要包括盐浓度、pH、溶液温度、表面活性剂和有机溶剂等，在分离应用上刚好与离子交换层析的应用互补，因此，两种层析配合应用，可以达到良好的分离效果。疏水层析常用于重组蛋白的初步分离纯化阶段。

（3）凝胶过滤层析。

凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）又称为分子筛层析（molecular sieve chromatography）或分子排阻层析（molecular-exclusion chromatography），是利用具有多孔网状结构的颗粒来分离不同相对分子质量的组分。常用的多孔网状结构颗粒是交联的惰性多聚糖凝胶，如葡聚糖或琼脂糖等。当流动相大分子溶液流经凝胶柱时，小分子物质能进入凝胶的多孔网状结构内部，而大分子物质却被排除在网状结构外部，于是大分子物质从颗粒之间的间隙中快速流出，小分子物质则在网状结构中流经更长的路程，将比大分子物质较晚流出固定相，于是样品中的各组分按照相对分子质量大小差异被分离。凝胶过滤（分子筛）层析原理如图2-18所示。

图2-18　凝胶过滤（分子筛）层析原理示意图

凝胶过滤层析的突出优点是分离用凝胶为惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件温和，可以在相当广的温度与pH范围内操作，不需要使用有机溶剂，对分离成分的理化性质不会产生不良影响。由于层析过程主要依靠组分流经路程长短来分离，层析玻璃柱的柱长与直径之比一般不低于10，不宜采用高压驱动，因此相对分离速度较慢，分离容量较小，常常成为分离纯化的限速步骤。凝胶过滤层析的用途：①分离纯化：在蛋白质、酶、氨基酸、激素、多糖、生物碱等物质的分离提纯中广泛应用，也利用凝胶对热原有较强的吸附力，从而去除水中的热原。②脱盐和浓缩：大分子溶液中的低相对分子质量杂质和电解质通过凝胶过滤层析法除去的过程称为脱盐，水分与小分子物质在网孔尺寸合适的凝胶中被截留，快速流出的大分子物质则得以浓缩。③相对分子质量测定：用已知相对分子质量的标准品系列作为对照，与待测样品在同一条件下层析，可在标准品制作的相对分子质量标准曲线上准确测量待测样品的相对分子质量。

（4）亲和层析。

亲和层析是基于抗原-抗体、酶-底物、激素-受体、生物素-亲和素等特异性结合反应的一种分离方式，每对特异性反应物之间都有较强的亲和力。将待分离的一种反应物（后文称作样品）溶解在流动相中，其对应的反应物（后文称作配体）固定在固定相上，当溶液流经固定相时，样品与固定相上的配体结合，其他物质流出或被洗涤掉，然后采用洗脱液将样品洗脱下来，获得分离纯化的样品。

通常情况下，亲和层析是将配体以共价键的方式结合固定到含有活化基团的基质上，制成亲和吸附剂或固相载体“基质-配体”。将固相载体装入层析柱中，当样品溶液通过该亲和柱时，样品借助静电引力、范德瓦耳斯力，或结构互补效应等作用吸附到固相载体，形成“基质-配体-样品”的结构，无亲和力或非特异性吸附的其他物质直接流出或被缓冲液洗涤出来，形成了第一个杂质层析峰。然后，通过适当地改变缓冲液的pH、离子强度或加入抑制剂等方法，可将样品从固相载体上解离下来，并形成第二个层析峰。如果待分离溶液中存在两个以上与固相载体具有亲和力的样品（亲和力有差异）时，采用选择性缓冲液洗脱，可以将其分开。固相载体经再生处理后可重复使用。

除了上述特异性配体亲和层析法外，还有通用性配体亲和层析法，通用性配体亲和层析法往往是一些特殊的配体，可以分离一些结构大致相同的样品。这些配体主要是简单的小分子物质，如金属、染料、氨基酸等，相对而言，易于大量制备，因此成本较低；同时这些配体一般具有较高吸附容量，可以通过改善吸附和脱附条件来提高层析分辨率，如6-His与镍金属亲和层析，GST与谷胱甘肽亲和层析，可以通过在样品中设计一段含6-His或GST结构的融合蛋白，以便采用亲和层析来快速高效分离。另有一些通用性配体，如葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A，简称protein A）和重组链球菌G蛋白（recombinant streptococcal protein G，简称protein G），在中性或碱性条件下，它们可与多种哺乳类动物IgG分子的Fc段特异性结合。因此，葡萄球菌A蛋白或重组链球菌G蛋白亲和层析是很多抗体分离纯化的首选方法。

（5）聚焦层析。

聚焦层析（focusing chromatography）是一种柱层析，其流动相为多缓冲剂（poly-buffer），是相对分子质量不同的多羧基多氨基化合物配制成的两性电解质性缓冲液；固定相为多缓冲交换剂（poly-buffer exchanger），是带有梯度电荷基团的两性基质，从柱的上端往下形成pH梯度，如pH 6～9。溶解在多缓冲液中的蛋白质溶液加入层析柱，当pH低于蛋白质的pI时，蛋白质带正电荷，不与交换剂结合，随着洗脱剂向下移动。固定相的pH随着淋洗时间延长而变化，当蛋白质移动至高于其pI的pH梯度带时，蛋白质开始带负电荷，并与交换剂结合。随着洗脱剂流过，当蛋白质所处环境pH再次低于pI时，它又带正电荷，并从交换剂上解析下来，随洗脱液移向柱底。反复进行上述过程，于是各种蛋白质在各自等电点段被洗脱下来，从而达到分离的目的。相同pI的蛋白质被聚集在一条很窄的区带，实现聚焦目的，而且分离的灵敏度很高。但由于蛋白质在pH梯度固定相中是一个流动—结合—洗脱的过程，真正能结合的是一段很短的区带，并且是一个反复的过程，再加上与蛋白质混合在一起的多缓冲液在后续处理中才能与蛋白质分离，因此，相对载荷不高，效率较低，增加了处理步骤，在实际生产制备中不太常用。

（6）高效液相色谱。

高效液相色谱（HPLC）又称高压液相色谱、高速液相色谱、高分离液相色谱和近代柱色谱等，是一种分离、鉴定和量化混合物中各组分的分析技术。HPLC采用输液泵使样品混合物液体加压流过填充有固体吸附材料的不锈钢柱，样品中的各组分依据与吸附材料的不同相互作用而导致流速不同，从而获得分离，进入检测器进行检测，实现对样品的分析。已被广泛应用于制造、司法、科研和医疗等领域。

HPLC必须采用高效液相色谱仪来实现其分析检测的功能，HPLC常常也被用于指代高效液相色谱仪。高效液相色谱仪一般由高压输液泵、色谱柱、进样器、检测器、收集器，以及数据获取与处理系统组成（图2-19）。高压输液泵是驱动流动相（有机溶剂、水或缓冲液）和样品通过色谱分离柱和检测系统的部件，一般能够耐受较高压力（30～60 MPa）；色谱柱是分离样品混合物各组分的关键部件，可反复使用，通常采用长10～30 cm、内径2～5 mm的内壁抛光不锈钢管柱，依据填充的吸附材料不同可将HPLC分成吸附色谱（adsorption chromatography）、分配色谱（partition chromatography）、离子色谱（ion chromatography）、分子排阻色谱/凝胶色谱（size exclusion chromatography）、键合相色谱（bonded-phase chromatography）和亲和色谱（affinity chromatography）等不同类型；进样器是将待分析样品引入色谱系统的部件，一般与注射器配合使用，或者采用自动进样器便于重复进样操作；检测器是将样品中被分离各组分在柱流出液中浓度的变化转化为光学或电学信号的部件，一般采用一种或多种不同的检测器来实现，常用的有紫外-可见分光光度检测器、二极管阵列紫外检测器、示差折光化学检测器、荧光检测器和电化学检测器等；收集器主要用于将分离的组分做其他分析鉴定，一般色谱分析不必使用；数据获取与处理系统的功能是将检测器检测到的信号以数据或波形的方式显示出来。

图2-19　高效液相色谱结构原理示意图

（7）气相色谱。

气相色谱（gas chromatography，GC）是分析化学中对那些可被气化而不分解的化合物进行分析或分离的通用色谱技术。GC主要用于特定物质的纯度分析和混合物中不同组分的分离，还可用于化合物的鉴定，或从混合物中制备某种纯品。GC的流动相为气体（常用惰性气体He或不活泼气体N2等），固定相可为固体（如活性炭、硅胶等）或液体（涂覆在惰性固体支持物表面的液体薄层或聚合物薄层，如角鲨烯等）。根据固定相的不同，GC分为气固色谱和气液色谱。气固色谱是德国物理化学家Erika Cremer于1947年与奥地利研究生Fritz Prior一起研究出来的。气液色谱是Archer Martin于1950年发明，他在1941年和1947年发明的液相色谱和纸层析为气相色谱的发展奠定了重要的基础。

GC与液相色谱的原理基本相同，都是在金属或玻璃柱中进行的柱层析。但是，也有几点差异：①流动相不同，GC的流动相是气体，液相色谱的流动相是液体；②GC的待分离（分析）样品需要通过一个气化室气化，需要控制样品气体的温度，液相色谱则不需要控制温度；③化合物气体的浓度只能反映其在蒸气压下的状况。气相色谱仪是开展气相色谱分析的必要设备。

多组分的混合样品进入色谱仪的气化室后气化并随气流带入色谱柱内，在固定相和流动相中不断地进行分配。当样品从色谱柱中流出，进入检测器时，信号被记录，并经过放大处理后在记录仪中记录下来。这个信号表现出一个峰形图，称为色谱峰或色谱图。根据不同组分在色谱柱中固定相和流动相中的停留时间不同，样品的组分得以分离。GC适合于微量样品的分离与分析，通常不作为重组蛋白药物分离纯化的技术方法，可以作为微量相关物质的分析检测方法。

（四）病毒的去除与灭活

采用哺乳动物细胞培养表达的重组蛋白在生产制备过程中可能污染病毒，因此要求采取一定的方式去除/灭活病毒。去除病毒是指将病毒从目的产物中清除或者分离出去的工艺过程；灭活病毒是指“杀死”病毒以强化安全性的工艺过程。根据不同生产工艺、可能感染病毒的种类，以及蛋白质自身的性质，采取不同的去除/灭活病毒的方法。一般最常用的去除/灭活病毒的方法有巴斯德消毒法、干热法、膜过滤法、有机溶剂/去污剂（S/D）处理法和低pH孵放法。

巴斯德消毒法（亦称巴氏消毒法）是对样品采用60℃连续加热，或间歇加热达到10 h的处理方法，巴氏消毒法对HIV和肝炎病毒等具有较理想的灭活效果。给予制品内部温度分布的均一性、灭活时间，和制品稳定剂等均需要进行验证。

干热法是指对制品在80℃连续加热72 h，可以灭活HBV、HCV、HIV和HAV等病毒，通常应用于冻干制品，需考虑制品的水分含量、制品组成对病毒灭活效果的影响。

有机溶剂/去污剂（S/D）处理法常用有机溶剂和非离子化去污剂结合，如0.3%磷酸三丁酯（TNBP）和1%吐温-80（或1%Triton X-100），在24℃下处理至少4h。该法可以灭活脂包膜病毒，但对非脂包膜病毒无效。

膜过滤法采用孔径比病毒有效直径小的滤膜（一般为纳滤）对重组蛋白样品进行过滤，可以达到去除病毒的目的，一般膜过滤法不单独使用，应与其他方法联合使用。过滤前后均需测试滤膜的完整性。

低pH孵放法是指在生产过程中，采用合适的缓冲液（如枸橼酸缓冲液或柠檬酸缓冲液）将蛋白样品pH调到较低值（如pH 4左右），在室温下孵育2h，基本可以灭活大部分脂包膜病毒。这个过程中可以加上一些酶类（如胃蛋白酶），充分考虑pH、孵放时间、温度、胃蛋白酶含量、蛋白质浓度等因素，以确定各种条件对病毒灭活的影响。部分文献或标准在血液制品制备过程中，严格要求温度控制在24℃，孵放时间为21天，这个不能作为所有产品灭活的条件，需要针对各类蛋白质分别制订合适的工艺条件。

辛酸处理法、离子交换层析、沉淀和光化学法在部分产品的制备工艺中也具有一定的去除/灭活病毒作用，但效果不理想，目前一般不作为去除/灭活病毒的专门工艺。在重组蛋白药物的生产中，目前最常用的是S/D法、低pH孵放法和膜过滤法。

在哺乳动物细胞培养表达重组蛋白药物的制备过程中，必须设计去除/灭活病毒的有效步骤。在完成该步骤后，尽量不采取其他后续工艺处理，而是对去除/灭活病毒的效果立即进行验证。如果必须进行后续处理，或者对多个采样点一并进行验证时，则要充分考虑这些过程对病毒验证的影响。要求至少验证其中2个去除/灭活病毒的步骤。验证时，尽量采用相关病毒，如果不能找到相关病毒，则必须选择理化性质相同的病毒，如病毒大小、核酸类型、外包膜等，至少要包括一种对去除/灭活病毒工艺有明显抗性的病毒。除了检查病毒滴度外，还需要验证重组蛋白样品的性质，除能够耐受去除/灭活病毒工艺外，样品不会发生结构、活性的变化。判断去除/灭活病毒工艺的有效性需要综合考虑，不能仅以病毒被去除/灭活的效果来确定。验证效果以去除/灭活病毒指数来确定工艺是否有效，去除/灭活病毒指数是指经过生产工艺步骤处理后，指示病毒感染量被去除/灭活的程度，通常以对数值表示；有效工艺步骤是指在验证研究中，能够使指示病毒感染量被去除/灭活达4log以上的特定工艺步骤。

（五）热原的去除与处理

热原是指能够引起机体体温异常升高的物质，如一些微生物的组成成分或代谢产物，称为外热原（如脂多糖等）；也有一些机体内的各种炎性因子，一般称为内源性热原或内热原。在重组蛋白药物制备过程中，去除或防止污染的热原物质主要指外热原。物品或试剂在非无菌环境中放置4h以上，一般可以检测到热原的存在。

热原具有耐热性，在60℃加热1h，或者加热到100℃，均不会发生降解；热原体积小，一般的过滤方式，甚至纳滤都不能截留；热原可以很好地溶于水中；热原一般不挥发，但可以随水蒸气进入蒸馏水中；热原与很多物质，尤其是蛋白质具有很强的亲和性，一旦吸附难以去除；而且热原能够耐受一般的酸碱和化学试剂的处理而不被破坏。要控制好热原，主要是做好热原的源头控制，如溶剂、原料、容器，以及制备过程等中的热原控制。去除热原的方法有超滤，层析，吸附，强热，强酸、强碱、强氧化剂处理及超声波等。

对于制备用水的热原控制，通常将新制备的蒸馏水或去离子水（活性炭可以吸附热原）立即高压灭菌，然后在密封无菌的管道中，70℃以上温度下保持循环，一般24 h内检查不到热原。对于重组蛋白制备过程的热原控制，一方面是控制热原的进入，另一方面是采用疏水层析、离子交换层析、超滤等方式降低样品中的热原含量。对于玻璃和金属材质的容器和器具的热原控制，可以采用强热、强酸、强氧化剂处理等方式去除热原。对于橡胶、塑料以及一些高分子材料，可以采用强酸、强碱、强氧化剂处理和超声波等方式去除热原。生产获得的原液和成品一般采用鲎试剂检查热原含量，产品热原含量需符合国家有关规定。