基质膜材料及其在生物分离中的应用

制备亲和膜，首先要合成和制备出能对生物大分子，如酶，蛋白质等有效地进行固载化的基质材料。理想的亲和膜材料应为亲水性，不对蛋白质等生物大分子产生非特异性吸附作用。另外，膜基质上含有可与配基进行共价键结合的活性官能团，如环氧基、氨基、羟基和羧基等。但是，由于这些带有活性官能基团的单体较难合成，聚合手段也比较复杂，而且在成型加工过程中官能团容易失活或脱落，往往达不到预期的效果。因此，对一些通用的商品膜进行化学修饰不失为一种行之有效的途径。

化学修饰的手段主要有两种，即表面接枝和涂层。Kubota等对聚乙烯中空纤维膜进行表面接枝聚甲基丙烯酸缩水甘油（PGMA），不仅引入了有反应活性的环氧基，而且使聚乙烯膜表面亲水化，大大降低了膜的非特异性吸附，这对蛋白质的选择性分离纯化具有重要意义。Schisla等对聚丙烯中空纤维膜进行聚乙烯醇表面涂层，使膜表面亲水化的同时，引入了活性的羟基，进一步活化后与三嗪类染料Procion Blue MX-R键合，可用作分离磷酸肌酸激酶的亲和膜。

由于通用商品膜性能稳定、易得，因此人们可以通过简单的化学修饰或涂层引入各种活性基团，再偶联所需要的配基，就可以制备对目标生物大分子具有特异性亲和吸附效果的亲和膜。常用的亲和膜载体材料有：纤维素、脂族聚酰胺（尼龙6、尼龙66）、脂族烃类（聚乙烯、聚丙烯）、芳香族共聚物（聚碳酸酯、聚砜、聚醚砜）、聚乙烯醇等。纤维素是最早用于亲和分离的介质之一，也是目前用得最广泛的亲和膜基质材料。纤维素膜上含有丰富的羟基，其具有很好的亲水性、生物兼容性及易于衍生化。将纤维素活化后接上间隔臂和配基就可使用。

商振华等用3-氯-1，2-环氧丙烷活化纤维素后接上对苯二胺作间隔臂，然后接上牛血清蛋白、活化染料K2BP和F3GA做配基，将所制得的一系列碟式亲和膜应用于α-干扰素、白蛋白和碱性磷酸酯酶等的分离纯化，效果良好。而后他们又在碱性条件下用3-氯-1，2-环氧丙烷活化滤纸后接上己二胺作间隔臂，然后用戊二醛交联法固载上组氨酸、多黏菌B，用于溶液中内毒素的去除，可使内毒素含量降低到0.04EU/mL。采用三嗪活化法，使2-氨基-4，6-二氯-1，3，5-三嗪与纤维素上的羟基相结合，制成亲和膜后可与蛋白质的氨基反应。也可采用溴乙酰溴将纤维素上的羟基进行酰化，再将酰化后的纤维素与蛋白质相结合。

杨利等以棉纤维为基质，通过聚合、接枝、开环反应合成了亚氨二乙酸型金属螯合复合亲和膜介质，该膜色谱介质对蛋白质具有较大的吸附容量，分离效果与凝胶介质相当，但分离速度快3～5倍。随后，杨利等又以纤维素为基质材料，制备了固定化镍离子亚氨二乙酸（IDA）型复合纤维素金属螯合亲和膜，该膜可对药用人血清蛋白进行纯化。魏琪、姚汝华等以纤维素滤纸为介质，通过碱处理、环氧活化、偶联亚氨基二乙酸二钠、固定化Cu2+后制得了大孔纤维素亲和膜。魏桂林、商振华等以纤维素为介质，活化后，键合壳聚糖配基，制成亲和层析膜介质，将此亲和层析膜介质用于去除人血蛋白溶液、氢化可的松注射液，右旋糖苷40葡萄糖注射液中的内毒素，去除率在95%左右。用于去除溶菌酶溶液，盐酸丁卡因注射液中的内毒素，去除率在80%以上。张海涛、聂华丽以纤维素滤纸膜为载体，染料CibacronBlue F3GA为配基，制备了一种适合分离纯化木瓜蛋白酶的新型亲和色谱介质。聚己内酰胺膜，即尼龙6膜因其优异的孔结构及易衍生化而被广泛应用，但尼龙膜上可利用的末端氨基较少，可采用酸水解的方法增加膜上可反应基团数目，并使其具有一定的亲水性，减少非特异性吸附。Klein等用1mol/LHCl将尼龙膜水解72h后，膜上氨基数目可增加4倍。商振华等将水解后的尼龙66微孔膜用二溴丙烷活化，接上己二胺做间隔臂，再用戊二醛法固载上组氨酸，制得的亲和膜可成功地去除氨基酸注射液、牛血清蛋白、溶菌酶等医药制剂中的内毒素，去除率在90%以上；偶合上含丰富羟基的多糖类物质如葡聚糖、纤维素、淀粉、羟乙基纤维素（HEC）等形成亲水表面层，制成复合膜。该类膜非特异性吸附很小，但孔径有所缩小。该法与水解法相比，可提供更多的活性位，得到的膜孔尺寸分布均匀，机械强度好。(www.xing528.com)

Petsch等用葡聚糖、聚乙烯醇、HEC改性尼龙膜后以聚赖氨酸、黏多菌酸等为配基制得一系列亲和膜用于去除缓冲液和蛋白质溶液中的内毒素，可将缓冲溶液中的内毒素从6000Eu/mL降到0.1Eu/mL；Kugel等在起始氨基浓度为21μmol/g膜的尼龙6中空膜上用氨基酸扩充膜上末端氨基，再偶合配基，改性膜Nglon-Ala-Lys、Nylon-Ala-Lys-Lys表面氨基浓度分别为26.1、39.3μmolNH2/g膜。甘宏宇，商振华等以尼龙膜为基质，L-色氨酸（Trp）为配基，合成了一种新的亲和膜用于吸附牛γ-球蛋白（BEG），亲和吸附量较大而非特异性吸附较小。它们还以尼龙膜为基质，分别采用三氯三嗪和1，4-丁二醇二缩水甘油醚活化法，制备出以L-赖氨酸为配基的亲和膜。使用该亲和膜成功地从人血浆中快速纯化出了高纯度的纤溶酶原。聂华丽等将尼龙膜经稀盐酸水解、壳聚糖改性后，以木瓜蛋白酶为亲和膜的配基，通过戊二醛的活化处理后采用共价结合的方法将配基键合在尼龙膜上，从而得到有特异吸附性能的尼龙亲和膜。用配基为木瓜蛋白酶的尼龙亲和膜从土豆汁中纯化半胱氨酸蛋白酶抑制剂，纯化倍数为7.25倍。薛茂强以具有良好血液相容性的壳聚糖和尼龙膜为基材，在尼龙膜上共价键偶合壳聚糖制备尼龙—壳聚糖复合膜，并选用对胆红素具有高亲和容量的聚赖氨酸作为配基，制备固载聚赖氨酸亲和膜，所制备的固载聚赖氨酸亲和膜对亲脂性毒物胆红素展现了较好的动力学分离性能。

聚砜是一种良好的成膜材料，但其固有的憎水性使它不能直接用作亲和分离介质，对聚砜膜表面偶合一层亲水层如纤维素、壳聚糖可增加其亲水性。Klein等用乙二醇二缩水甘油（EGDGE）活化聚砜膜后偶合上HEG，再经EGDGE活化后键和上己二胺做间隔臂，再偶合上活化的重组蛋白质rPrA做配基，从而制得一系列亲和膜。另外，还可以用胺化的方法活化聚砜膜。商振华等采用酰化-胺化和氯甲基化-胺化等途径对聚砜膜进行改性，在芳环上引入末端氨基，制得的亲和膜已被用于胰蛋白的固载化和对其抑制剂的亲和分离，制成固载化金属亲和膜（IMAM）。聚砜中缺电子芳环上的氢原子易被金属有机化合物中的金属原子取代，常用的有机金属试剂是正丁基锂，C-Li键的极性使之可以和亲和试剂如甘油基-4-氧化己谜反应，末端环氧基与亚氨基二乙酸（IDA）反应后螯和金属离子如Zn2+、Cu2+、Ni2+。Klaus Rodemann等用改性聚砜膜分离4种氨基酸混合物（组氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丙氨酸）。他们研制的两种聚砜膜，一种膜中含金属Li，一种没有，然后用两种不同的缩水甘油醚分别对其改性，获得了4张不同特性的基膜，再在膜中引入IDA和铜离子。选出两种铜离子吸附能力大的膜EPSU-IDA-1和ESart-IDA-1，用于氨基酸混合物的分离。氨基酸混合物的亲和分离在死端超滤池内进行，膜两端压差为45kPa。不易与铜离子结合的氨基酸首先透过膜，易与铜离子牢固结合的氨基酸滞留在膜内，形成了络合物。当络合饱和后，多余的氨基酸透过膜流出，根据流出时间不同将4种氨基酸分离。实践结果表明，4种氨基酸与铜离子的结合性能最强的是组胺酸，其次是苯丙氨酸、苏氨酸、丙氨酸。

对聚烯烃多用辐射诱导接枝甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）的方法以增加其亲水性。Kiyohara等在聚丙烯多孔中空纤维膜上接枝丙烯酸和GMA，用L-氨基酸做配基制得亲和膜，结果表明接枝上GMA后膜的性能优于接枝丙烯酸。Kim等在聚丙烯中空纤维膜上辐射诱导接枝上GMA，用苯丙氨酸、色氨酸做配基，吸附γ-球蛋白（BGG）。Legallais等采用乙烯和乙烯醇的共聚从而制得有良好的机械强度和一定亲水性的中空纤维膜，用1，4-丁二醇二缩水甘油基醚活化后偶合上组氨酸做配基，可用于从IgG溶液中去除内毒素。郑宇、陈欢林等用低温等离子体方法对聚丙烯微孔膜表面进行改性，分析了等离子体处理条件对羟基、羧基等多种含氧基团产生量的影响，进一步对改性膜进行活化、偶联及螯合，制备出亚胺二乙酸-铜离子（IDA-Cu2+）亲和膜。所制备的Cu2+离子金属螯合亲和膜用于对溶菌酶的吸附，在20min和68W的最佳条件下，对溶菌酶的吸附量为8μg/cm2。李静、陈欢林等采用低温氧或氨等离子体法改性聚丙烯微孔膜，基于等离子体改性膜的活化、偶联及螯合过程的机理，制备了Fe3+，Ni2+，Cu2+和Zn2+等金属离子螯合亲和膜，并用于溶菌酶的吸-脱附实验。实验结果表明，Ni2+和Cu2+离子螯合亲和膜对溶菌酶均具有较高的吸附量。螯合过程中采用氯化物盐溶液制得的膜对溶菌酶吸附量比采用硫酸盐溶液制得的膜的吸附量高。两种膜的重复吸-脱附性能相近，而Fe3+螯合亲和膜基本上不能用于重复吸-脱附实验。Ruckenstein等开展了用聚乙酰氨基葡萄糖（Chitin）亲和膜分离溶菌酶的研究。王兵、孙彦伟利用Gabriel反应，氯甲基化聚砜（DMPSf）与邻苯二甲酰亚胺的钠盐发生亲核取代反应，所得产物进一步肼解，合成出一种新型的氨甲基化聚砜（AMPSf）。通过分别考察氢化钠（NaH）用量、反应温度和时间等因素对反应规律的影响。获得较佳的改性条件：NaH用量1.2000g，反应温度80℃，反应时间10h。采用相转化法将其制备亲和膜，通过静态实验测定酰氯在膜上的吸附性能得到酰氯在膜上的吸附量高达62.34mg/g；初始酰氯溶液浓度对酰氯的吸附量有较明显的影响；吸附行为满足Freundlich吸附模型。徐堃以L-丝氨酸（Ser）为配基，1，6-己二胺为间隔臂，制备了一种新型PVDF中空纤维亲和用于人血浆中内毒素脱除亲和膜，对内毒素的吸附能力为0.058EU/cm2；自制的亲和膜组件对内毒素含量为0.42EU/mL的人血浆样品清除率为43.8%。由以上膜的改性过程可以看出膜在改性及接配基时需先活化，活化试剂一般用双官能团试剂如溴化氰、戊二醛、三嗪、3-氯-1，2-环氧丙烷、1，4-丁二醇二缩水甘油基醚、EGDGE等，Narayanan对此做过有关综述。理想的活化应满足：条件温和、快速、高效，形成的活性基团能与配基形成稳定共价键；偶合配基后剩余活性基团能用简单的方法封闭；所用试剂无毒、便宜、易于放大使用。