基因芯片技术及应用简介

基因芯片(genechip)是生物芯片的一种,该技术是20世纪90年代兴起的前沿生物技术,该技术具有快速、高效、大规模、高容量、高并行性等特点,其研究结果具有高度的特异性、灵敏性和重复性,为生命科学、医学等领域的研究提供了一个强有力的工具。它可以将生物学中许多不连续的分析过程,移植到固相的介质芯片上,并使其连续化和微型化。这对传统生物技术,如检测、DNA杂交、分型和测序技术将是重大的创新和飞跃。由于它横跨生命信息、生物物理等众多的研究领域,涉及生命科学、化学、计算机学、生物信息学等诸多自然学科,故已成为当今多学科交叉、综合的研究热点。本节将对基因芯片在食源性致病菌检测中的应用作一介绍。

(一)基因芯片技术概述

1.基因芯片原理

基因芯片(Genechip),又称DNA芯片(DNAchip)或DNA微阵列(DNA microarray),它综合运用了微电子学、物理学、化学及生物学等高新技术,把大量基因探针或基因片段按照特定的排列方式固定在硅片、玻璃、塑料或尼龙膜等载体上,形成致密、有序的DNA分子点阵。因其固相载体常用硅玻片或硅芯片,故称之为基因芯片。微生物样品DNA经PCR扩增后制备荧光标记探针,然后再与芯片上寡核苷酸点杂交,最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物。

基因芯片技术目前已开始应用于食品安全的检测。此外也广泛应用于DNA测序,基因表达和表达差异;基因突变和基因组多态性检测;病原分析;基因诊断和疾病预后分析;病理学、毒理学、药理学、疫苗研究和肿瘤研究等多个方面。

2.基因芯片的分类

基因芯片按其功能可分为表达谱基因芯片、诊断芯片和检测芯片;根据芯片点样方式的不同,可分为原位合成芯片、微矩阵芯片和电定位芯片;根据芯片所用探针的不同可分为寡核苷酸芯片和cDNA芯片。

3.基因芯片技术检测食源性致病菌的程序

(1)PCR扩增引物及基因芯片探针设计

细菌间16S rRNA保守性强,在生物进化过程中比其他基因演化的慢,被冠之以细菌分类的“化石”。但细菌的16S rRNA保守性又是相对的,在16S rRNA基因中既有序列一致的恒定区,也有序列互不相同的可变区,恒定区和可变区交错排列。因此可以在16S rRNA恒定区设计PCR引物,用一对引物就可以将所有致病菌的相应基因片段全部扩增出来,可在可变区设计检测探针并制作基因芯片。

(2)制备芯片

对芯片的介质表面进行氨基化、硅烷化或二硫键修饰处理是基因芯片技术的重要组成部分。利用基因芯片点样仪,将引物及探针DNA分子点涂在经过修饰的玻片等载体上,即制成芯片。DNA芯片的制作有几种不同的方式：1)芯片外合成制备芯片,如化学喷射法和接触式点涂法;2)原位合成制备芯片,如高压电喷头合成法和光引导原位合成法。所用寡核苷酸均先已合成完毕,再固定于载体上。所用寡核苷酸均是在载体上被合成与固定,使成芯片。芯片制备好后,便可用于检测食品中未知致病菌。

(3)待测食源性致病菌样品处理

待测致病菌样品在培养后进行裂解,提取致病菌的模板DNA,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增,对扩增出来的产物进行荧光标记。再用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测,得到的荧光标记产物可用于杂交试验。

(4)杂交

将扩增后并已标记的待测致病菌DNA标品滴加于基因芯片上,与芯片上的特异性DNA进行杂交。被检测的致病菌如果存在,其DNA便与芯片DNA杂交成功,经洗涤晾干后,进行结果分析。(www.xing528.com)

(5)结果检测与分析

采用芯片扫描仪,如荧光扫描仪、共聚焦显微镜等进行检测,根据荧光的有无及强弱来确定被测致病菌是否存在。

(二)基因芯片技术在食品致病菌检测中的应用

1.基因芯片技术与常规方法的比较

食品在生产、运输、销售过程中容易受致病性微生物污染,因此食品卫生检验中的一个十分重要的内容是及时准确地检测出食品中的致病性微生物。这些致病性微生物的存在会给消费者的健康带来极大的危害。目前,国内外对食品微生物中病菌的检测包括常见的致病菌,如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺菌、沙门氏菌等,常规检测方法主要有传统生化培养检测法、探针杂交、PCR法。传统方法是采用细菌培养、生化鉴定与血清分型,由于操作简单、经济而被广泛采用,但检测时限长(一般要1～2周),效率低、灵敏度不高。探针杂交和PCR技术准确、灵敏、快速(PCR 2～4 h,探针杂交需要的时间稍长一些),弥补了传统方法的不足,国内外关于这2种技术在医学微生物检测方面的研究报道很多。但PCR法由于假阳性影响及检测成本昂贵而在应用中受到限制;探针杂交操作繁杂、检测时限长;因此这两种技术并没有真正在实际检测中得到大量应用。可见常规检测方法检测食品中的致病菌已经不能满足快速检测的要求;难以适应飞速发展的现代食品生产和流通领域;因此为了确保食品的安全性;开发快速检测致病菌的方法;准确地检测食品中的致病菌具有十分重要的意义。

2.基因芯片技术检测食品中的常见致病菌

1996年,世界上第一块商业化DNA芯片的问世,标志着基因芯片技术进入广泛研究和应用的阶段,该技术具有传统的检测方法不可比拟的优越性：

(1)基因芯片可以对食品中的致病菌实行高通量和并行检测,一次实验即可得出全部检测结果。

(2)操作简便快速,整个检测在几小时内即可得出检测结果。

(3)特异性强,敏感性高。随着基因芯片检测食品中致病菌技术的不断发展和完善,将广泛应用于出入境、食品安全指标、突发事件等致病菌的检测,食品安全必将得到进一步保障,并且将对整个食品领域产生深远的影响。

据现有报道,顾鸣等人曾采用复合PCR方法扩增了致病菌特异性DNA片段,结合制备出含有11种不同致病菌特异性核苷酸探针的基因芯片,并应用于不同食源性致病菌鉴定,检测灵敏度达620 CFU/g,特异性高,芯片质量稳定。靳连群等采用合成后点样的方法制成用于致病菌检测的基因芯片,在相同条件下,扩增了涉及12个菌属的151株细菌的16S rDNA基因片段并与基因芯片杂交,对得到的扫描图进行分析,并得到一套属(种)特异的典型杂交图谱。该方法的主要原理是将待检的样品菌与基因芯片进行杂交,通过将杂交结果与典型图谱比对判断出样品种类。根据其对实际样品中所分离细菌检测结果,准确率达到了96.2%。Borucki等构建了一个包括24种L.monocytogenes菌株,585个探针组成的基因组芯片。结果表明,该基因组芯片适用于区分近缘的L.monocytogenes,与脉冲电泳技术分型结果基本一致。这种区分遗传标记的功能可用于流行病学并有可能应用于发病机理研究。

(三)基因芯片技术存在的问题及展望

在过去的十几年间,全球各家生物芯片公司都在不断研发,提高自己的产品性能、质量和生产服务能力,以满足市场的需求。产品包括：全基因组表达谱芯片、小RNA芯片、Human CGH+SNP芯片、基因芯片微阵列扫描仪等。美国昂飞公司(Affymetrix,Inc.),全球第一家生物芯片公司,提供“完整的基因芯片解决方案”。Illumina公司,提供基于微阵列技术的产品和服务,包括SNP基因分型、基因表达和蛋白质分析等。罗氏,以其特有的DNA芯片技术为市场提供优质整体解决方案。PerkinElmer公司,提供完整的生物芯片系统解决方案,涵盖芯片制备、点样、标记、杂交、扫描、数据分析等完整工作流程。安捷伦公司,拥有专利的基因芯片的制造工艺—喷墨打印化学原位合成技术。此外具有国际竞争力的还有荷兰Agendia公司、美国Pathwork公司。在国内,2000年成立的北京博奥生物集团有限公司,研制开发出了生物芯片及相关仪器设备、试剂耗材、软件数据库等四个系列数十项具有自主知识产权,亦具有较强的国际竞争力。除了博奥生物,我国的知名生物芯片领域还有一批技术和产品各具特色的公司。其中三十多个生物芯片或相关产品获得了国家新药证书、医疗器械证书或其他认证,并已实现产业化生产。目前,生物芯片在个体化用药指导、肿瘤的分子诊断、结核病的分子诊断、微生物的快速检测、遗传病检测等多个领域得到了广泛的应用。

基因芯片技术在食源性致病菌基因芯片发展和应用方面,国内外已有很多家公司有相关仪器设备、试剂耗材、软件数据库的产品,并日趋自动化、智能化。标准化方面我国在出入境检验检疫方面率先得到应用,当前使用的有SN/T 1543-2005食源性致病菌基因芯片鉴定方法和SN/T 2651-2010肉及肉制品中常见致病菌检测方法等。随着基因芯片技术的不断发展,生产和应用成本的降低,标准化和普及化基因芯片技术的不断推出,加之其高通量、快速、灵敏的特点将使基因芯片技术在食源性致病菌检测中应用将日趋广泛。