纸色谱法在仪器分析中的应用

1.基本原理

纸色谱法（PC）是以纸纤维作为载体的色谱法。按分离原理属于分配色谱的范畴，其固定相为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相混溶的有机溶剂，纸纤维只是起到一个惰性支持物的作用。除水以外，纸也可以吸留甲酰胺、缓冲溶液等。

由于纸色谱的固定相为水，因此只有那些极性较大的化合物才能被水保留。故纸色谱只适合于分离极性较大、在水中有一定溶解度的物质，如无机盐、氨基酸、多羟基糖等。作为载体的层析滤纸，一般可以吸附20%～26%的水分，其中6%左右通过氢键与纤维素上的羟基形成复合物，这部分水与展开剂形成不相混溶的两相，从而实现分配分离。分离后各组分在纸色谱中的保留行为也常用Rf值来表达。Rf值与分配系数的关系式与薄层色谱中相似。

2.实验方法

滤纸选择：作为纸色谱的载体，滤纸应具备如下条件：纯植物纤维制成；质地与厚薄均匀平整，松紧适宜；强度好，被溶剂润湿后仍能悬挂。

滤纸处理：要想获得更好的分离效果，根据需要还可对滤纸进行前处理。处理的方式有除杂处理、改性处理和反相处理等。

除杂处理：将滤纸在稀盐酸中浸泡，然后用蒸馏水洗涤，再用丙酮-乙醇（1∶1）的混合溶液中浸泡，取出风干，可除去大部分杂质。

改性处理：将滤纸预先用一定pH的缓冲溶液处理能克服拖尾现象。在滤纸上加一定浓度的无机盐，可调整纸纤维中的含水量，改变组分在两相间的分配比例，改善分离效果，如某些混合物生物碱的分离可采用此法。

反相改性：将溶剂系统中的亲脂性液层固定在滤纸上作为固定相，水分亲水性溶剂作为流动相，即采用反相纸色谱法分离一些亲脂性强、水溶性小的化合物。操作时先制备疏水性滤纸，以改变滤纸的性能，适合水或亲水性溶剂系统的展开。另一种方法是将滤纸纤维经过化学处理使其产生疏水性，例如乙酰化滤纸就是常用的一种。

3.点　样(www.xing528.com)

溶液样品可直接点样。对固体样品，应采用极性与展开剂相似的溶剂配制，一般用乙醇、丙酮、氯仿等有机溶剂。点样量的多少由滤纸的性能、厚薄及显色剂的灵敏度来决定，一般从几到几十微克。纸色谱更适合微量样品的分离。点样方法与薄层色谱相同。

4.展　开

纸色谱最常用的展开剂是水饱和的正丁醇、正戊醇、酚等。为了防止弱酸、弱碱的解离，有时需加入少量的酸或碱，如乙酸、吡啶等。如用正丁醇-乙酸作流动相，应先在分液漏斗中把它们与水振摇，静置分层后放掉下部水相，获得被水饱和的有机相作展开剂。有时加入一定比例的甲醇、乙醇等以增加展开剂的极性，增强它对极性化合物的展开能力。

展开前，将展开剂倒入展开槽中盖好盖子，使槽内充满溶剂的饱和蒸气，然后才将滤纸点有样品的下端浸入溶剂中进行展开。

纸色谱的展开方式通常为上行法，在制备时也可用大些的滤纸弯成U形，在圆柱形缸内上行展开。上行展开速率慢、展开距离短，也可用下行法展开，溶剂借助于重力和纤维的毛细管效应向下移行，速率较快，展开距离增大，分离效果好。对于复杂样品，还可选用双向展开、多次展开等多种展开方式。

5.检　视

当展开完毕后，取出滤纸后立即标识展开剂前沿的位置，确定L0。除了腐蚀性显色剂外，凡是用于薄层色谱的显色剂都可以用于纸色谱的检视。用于生化分离的纸色谱，应采用生物检定法检视。例如分离抗菌作用的成分时，将纸色谱加到细菌的培养基内，经过培养后，根据抑菌圈出现的情况来确定化合物在纸上的位置。也可以用酶解法，例如无还原性的多糖或苷类，在纸色谱上经过酶解，生成还原性的单糖，就能用氨性硝酸银试剂显色。还可以利用化合物中所含有的示踪放射性核素来检视化合物在纸色谱上的位置。

依据展开剂移动的距离L0、样品组分斑点移动的距离Li，计算Rf,i值，并与对照品组分的Rf,s值相比较，得出定性结论。