核酸探针标记的方法在《分子微生物学实验指导》的一节中详述

根据核酸的性质，核酸探针可分为DNA探针和RNA探针；根据是否使用放射性标记物，可分为放射性标记探针和非放射性标记探针；根据是否存在互补链，可分为单链探针和双链探针；根据放射性标记物的掺入情况，可分为均匀标记探针和末端标记探针。下面将介绍各种类型的探针及标记方法。

1.双链DNA探针及其标记方法

分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。双链DNA探针的合成方法主要有下列两种：切口平移法和随机引物合成法。

（1）切口平移法（nick translation）当双链DNA分子的一条链上产生切口时，E.coliDNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3′羟基末端。同时该酶具有从5′→3′的核酸外切酶活性，能从切口的5′端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3′端补上核苷酸，从而使切口沿着DNA链移动，用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50～500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响：产物的比活性取决于[α-³²P] dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度；DNA酶Ⅰ的用量和E.coliDNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小；DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性，故应使用仔细纯化后的DNA。

①材料 待标记的DNA。

②设备 高速台式离心机，恒温水浴锅等。

③试剂

a.10×切口平移缓冲液 0.5mol/L Tris-HCl（pH 7.2），0.1mol/L MgSO₄，10mmol/L DTT，100μg/mL BSA。

b.未标记的dNTP原液 除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外，其余3种分别溶解于50mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）溶液中，浓度为0.3mmol/L。

c.[α-³²P]dCTP或[α-³²P]dATP 400Ci/mmol，10 μCi/μL。

d.E.coliDNA聚合酶Ⅰ（4U/μL）溶于50μg/mL BSA，1mmol/L DTT，50%甘油，50mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）中。

e.DNA酶Ⅰ 1mg/mL。

f.EDTA 200mmol/L（pH 8.0）。

g.10mol/L NH₄Ac。

④操作步骤

a.按下列配比混合：

b.置于15℃ 水浴60min。

c.加入5μL EDTA终止反应。

d.反应液中加入乙酸铵，使终浓度为0.5mol/L，加入两倍体积预冷的无水乙醇沉淀回收DNA探针。

⑤注意事项

a.³H、³²P及³⁵S标记的dNTP都可使用于探针标记，但通常使用[α-³²P]-dNTP。

b.DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探针比活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，则所得探针比活性高，但长度比较短。

（2）随机引物合成法 随机引物合成双链探针的原理是使寡核苷酸引物与DNA模板结合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常，产物平均长度为400～600个核苷酸。

利用随机引物进行反应的优点是：①Klenow片段没有5′→3′外切酶活性，反应稳定，可以获得大量的有效探针。②反应时对模板的要求不严格，用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。③反应产物的比活性较高，可达4×10⁹cpm/μg探针。④随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。

①材料：待标记的DNA片段。

②设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。

③试剂

a.随机引物 随机六聚体或断裂的鲑鱼精子DNA。

b.10×随机标记缓冲液 900mmol/L HEPES（pH 6.6），10mmol/L MgCl₂。

c.Klenow片段。

d.20mmol/L DTT。

e.未标记的dNTP溶液dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L。

f.[α-³²P]dATP比活性大于3000Ci/mmol，10μCi/μL。

g.缓冲液A 50mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），50mmol/L NaCl，5mmol/L EDTA（pH 8.0），0.5%SDS。

④操作步骤

a.200ng双链DNA（1μL）和7.5ng随机引物（1μL）混合后置于EP管内，水浴煮沸5min后，立即置于冰浴中1min。

b.与此同时，尽快在一置于冰浴中的0.5mL EP管内混合下列化合物：

c.将步骤aEP管中的溶液移到步骤b管中。

d.加入5U（约1μL）Klenow片段，充分混合，在微型离心机中以12000×g离心1～2s，使所有溶液沉于试管底部，在室温下保温3～16h。

e.在反应液中加入10μL缓冲液A后，将放射性标记的探针保存在-20℃下备用。同时计算放射比活性。

⑤注意事项

a.引物与模板的比例应仔细调整。当引物高于模板时，反应产物比较短，但产物的累积较多；反之，则可获得较长片段的探针。

b.模板DNA应是线性的，如为超螺旋DNA，则标记效率不足50%。

2.单链DNA探针

用双链探针杂交检测另一个远缘DNA时，探针序列与被检测序列间有很多错配。而两条探针互补链之间的配对却十分稳定，即形成自身的无效杂交，结果使检测效率下降。采用单链探针则可解决这一问题。单链DNA探针的合成方法主要有下列两种：①以M₁₃载体衍生序列为模板，用Klenow片段合成单链探针；②以RNA为模板，用反转录酶合成单链cDNA探针。

（1）从M₁₃载体衍生序列合成单链DNA探针合成单链DNA探针可将模板序列克隆到噬粒或M₁₃噬菌体载体中，以此为模板，以特定的通用引物或以人工合成的寡核苷酸为引物，在[α-³²P]-dNTP的存在下，由Klenow片段作用合成放射标记探针，反应完毕后得到部分双链分子。在克隆序列内或下游用限制性内切酶切割这些长短不一的产物，然后通过变性凝胶电泳（如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）将探针与模板分离开。双链RF型M₁₃DNA也可用于单链DNA的制备，选用适当的引物即可制备正链或负链单链探针。

①实验材料 已制备好的单链DNA模板。

②实验设备 高速台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪等。

③实验试剂

a.10×Klenow缓冲液 0.5mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl（pH 7.5），0.1mol/L MgCl₂。

b.0.1mol/L DTT溶液。

c.[α-³²P]dATP 3000Ci/mmol，10μCi/μL。

d.未标记的dNTP溶液 40mmol/L和20mmol/L。

e.dCTP，dTTP，dGTP各20mmol/L的溶液。

f.Klenow片段 5U/mL。

g.适宜的限制性内切酶 如EcoRⅠ、HindⅢ等。

h.0.5mol/L EDTA（pH 8.0）。

i.其他：酚∶氯仿，乙醇，电泳用试剂。

④操作步骤

a.在0.5mL EP管中混合如下溶液：

b.将EP管加热到85℃5min，在30min内，使小离心管降到37℃。

c.依次加入：

混合均匀后，稍离心使之沉于试管底部。

d.加1mL（5U）Klenow酶室温下30min。

e.加1mL 20mmol/L未标记的dATP溶液20min。

f.68℃加热10min，使Klenow片段失活。调整NaCl浓度，使之适宜于酶切。

g.加入20U限制性内切酶（如EcoRⅠ，HindⅢ等）酶切1h。

h.酚∶氯仿抽提DNA，乙醇沉淀以去除dNTP，或加0.5mol/L EDTA（pH 8.0）至终浓度10mmol/L。

i.用电泳方法分离放射性标记的探针。

（2）从RNA合成单链cDNA探针cDNA单链探针主要用来分离cDNA文库中相应的基因。用RNA为模板合成cDNA探针所用的引物有两种：①用寡聚dT为引物合成cDNA探针。本方法只能用于带poly（A）的mRNA，并且产生的探针绝大多数偏向于mRNA 3′末端序列。②可用随机引物合成cDNA探针。该法可避免上述缺点，产生比活性较高的探针。但由于模板RNA中通常含有多种不同的RNA分子，所得探针的序列往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多，应预先尽量富集mRNA中的目的序列。反转录得到的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后，RNA单链可被迅速地降解成小片段，经葡聚糖凝胶G-50柱层析即可得到单链探针。(www.xing528.com)

①实验材料 已提纯的RNA或mRNA。

②实验设备 高速台式离心机，恒温水浴锅，葡聚糖凝胶G-50层析柱等。

③实验试剂

a.合适的引物 随机引物或oligo（dT）。

b.5mmol/L dGTP，dATP，dCTP，dTTP。

c.[α-³²P]dCTP（＞3000Ci/mmol，10mCi/mL）。

d.反转录酶（200000U/mL）。

e.100mmol/L DTT。

f.250mmol/L MgCl₂。

g.1mol/L KCl。

h.0.5mol/L EDTA（pH 8.0）。

i.10% SDS。

j.RNasin（RNA酶抑制剂）（40U/mL）。

k.其他 1mol/L Tris-HCl，3mol/L NaOH，2mol/L HCl，酚∶氯仿，乙醇。

④操作步骤

a.在已置于冰浴的灭菌离心管中加入下列试剂：

混匀后，稍稍离心，37℃保温2h。

b.反应完毕后加入下列试剂：

c.加入3mL 3mol/L NaOH，68℃保温30min以水解RNA。

d.冷却至室温后，加入 10mL 1mol/L Tris-HCl（pH 7.4），混匀，然后加入3mL 2mol/L HCl。

e.酚∶氯仿抽提后，用葡聚糖凝胶G-50柱层析或乙醇沉淀法分离标记的探针。

3.末端标记DNA探针

现以Klenow片段标记3′末端为例说明末端标记的方法。

（1）实验材料 待标记的双链含凹缺3′末端的DNA。

（2）实验设备 高速台式离心机，水浴锅，葡聚糖凝胶G-50层析柱等。

（3）实验试剂

①3种不含标记的dNTP各为200mmol/L。

②合适的限制性内切酶。

③ [α-³²P]dNTP 3000Ci/mmol，10mCi/μL。

④Klenow片段（5U/mL）。

⑤10×末端标记缓冲液 0.5mol/L Tris-HCl（pH 7.2），0.1mol/L MgSO₄，1mmol/L DTT，500mg/mL BSA。

⑥其他 第四种核苷酸溶液，酚∶氯仿，乙醇。

（4）操作步骤

①25μL反应体系中用合适的限制酶酶切1μg的DNA。

②按下列成分加入试剂并混匀：

③加入1U的Klenow片段，室温下反应30min。

④加入1mL 2mmol/L第四种核苷酸溶液，室温保温15min。

⑤70℃加热5min，终止反应。

⑥用酚∶氯仿抽提后，用乙醇沉淀来分离标记的DNA，或用葡聚糖凝胶G-50柱层析分离标记的DNA。

（5）注意事项

①利用本方法可对DNA分子量标准进行标记，利用它可定位因片段太小而无法在凝胶中观察的DNA片段。

②对DNA纯度的要求不很严格，少量制备的质粒也可进行末端标记合成探针。

③末端标记还有其他的一些方法，如利用T₄多核苷酸激酶标记脱磷的5′端突出的DNA和平末端凹缺DNA，也可利用该酶进行交换反应标记5′末端。

4.寡核苷酸探针

利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的点突变。常用的寡核苷酸探针主要有两种：单一已知序列的寡核苷酸探针和许多简并性寡核苷酸探针组成的寡核苷酸探针库。单一已知序列寡核苷酸探针能与它们的目的序列准确配对，可以准确地设计杂交条件，以保证探针只与目的序列杂交而不与序列相近的非完全配对序列杂交，对于一些未知序列的目的片段则无效。

（1）材料 待标记的寡核苷酸（10pmol/μL）。

（2）设备 高速台式离心机，恒温水浴锅，葡聚糖凝胶G-50层析柱等。

（3）试剂

①10×T₄多核苷酸激酶缓冲液 0.5mol/L Tris-HCl（pH 7.6），0.1mol/L MgCl₂，50mmol/L DTT，1mmol/L亚精胺·HCl，1mmol/L EDTA（pH 8.0）。

② [γ-³²P]ATP（比活性7000Ci/mmol；10mCi/mL）。

③T₄多核苷酸激酶（10U/mL）。

（4）操作步骤

①100ng寡核苷酸溶于30mL水中。置65℃变性5min，迅速置冰浴中。

②立即加入下列试剂：

混匀后置37℃水浴20min。

③再加入20U T₄多核苷酸激酶，置37℃水浴20min后立即置冰浴中。

④葡聚糖凝胶G-50柱层析。

此方法是在每个探针的5′末端多加了一个磷酸，理论上，这会影响其与DNA的杂交。因此，建议使用Klenow DNA聚合酶的链延伸法获得高放射性的寡核苷酸探针。

除了常见的同位素标记探针外，还有利用非同位素标记探针和杂交的方法。许多公司都有不同的非同位素标记探针的杂交系统出售，可根据这些公司所提供的操作步骤进行探针的标记和杂交。

5.RNA探针

许多载体如pBluescript、pGEM等均带有来自噬菌体SP₆或E.coli噬菌体T₇或T₃的启动子，它们能特异性地被各自噬菌体编码的依赖于DNA的RNA聚合酶所识别，合成特异性的RNA。在反应体系中若加入经标记的NTP，则可合成RNA探针。RNA探针一般都是单链，它具有单链DNA探针的优点，又具有许多DNA单链探针所没有的优点，主要是RNA∶DNA杂交体比DNA∶DNA杂交体有更高的稳定性，所以在杂交反应中RNA探针比相同比活性的DNA探针所产生信号要强。噬菌体依赖DNA的RNA聚合酶所需的rNTP浓度比Klenow片段所需的dNTP浓度低，因而能在较低浓度放射性底物的存在下，合成高比活性的全长探针。用来合成RNA的模板能转录许多次，所以RNA的产量比单链DNA高。

反应完毕后，用无RNA酶的DNA酶Ⅰ处理，即可除去模板DNA，而单链DNA探针则需通过凝胶电泳纯化才能与模板DNA分离。

另外噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶不识别克隆DNA序列中的细菌、质粒或真核生物的启动子，对模板的要求也不高，故在异常位点起始RNA合成的比例很低。因此，当将线性质粒和相应的依赖DNA的RNA聚合酶及4种rNTP一起保温时，所有RNA的合成，都由这些噬菌体启动子起始。而在单链DNA探针合成中，若模板中混杂其他DNA片段，则会产生干扰。但它也存在着不可避免的缺点，因为合成的探针是RNA，它对RNase特别敏感，因而所用的器皿试剂等均应仔细地去除RNase；另外如果载体没有受到很好的酶切，则等量的超螺旋DNA会合成极长的RNA，它有可能带上质粒的序列而降低特异性。

6.几种常见的分子杂交

分子杂交是通过各种方法将核酸/蛋白质分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类。

（1）Southern杂交DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。

（2）Northern杂交RNA片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后用探针杂交。被检对象为RNA，探针为DNA或RNA。

根据杂交所用的方法，另外还有斑点（dot）杂交、狭槽（slot）杂交和菌落原位杂交等。有3种固相支持体可用于杂交：硝酸纤维素滤膜、尼龙膜和Whatman 541滤纸。不同商标的尼龙膜需要进行不同的处理，在DNA固定和杂交的过程中要严格按生产厂家的说明书来进行。Whatman 541滤纸有很高的湿强度，最早用于筛选细菌菌落。该滤纸主要用于筛选一些基因文库。固定化DNA的杂交条件基本与使用硝酸纤维素滤膜时所建立的条件相同。Whatman 541滤纸与硝酸纤维素滤膜相比有一些优点：它更便宜，杂交中更耐用，干燥过程中不易变形和碎裂等。然而若变性过程不小心，杂交信号的强度会明显弱于用硝酸纤维素滤膜时所得到的信号强度。因此，常规的细菌筛选和各种杂交时仍选用硝酸纤维素滤膜作为固相支持体。

（3）Western杂交其原理与Southern杂交或Northern杂交方法类似，但Western杂交采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键的形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。