骨髓细胞学检查：毒理学安全性评价研究指南

第三节　骨髓细胞学检查

一、为什么进行骨髓细胞学检查

在下列情况下，需进行骨髓细胞学研究：①当发现外周血细胞计数异常时；②最常见的是持续性嗜中性粒细胞减少症；③不能解释的血小板减少症，再生障碍性贫血；④增殖异常，骨髓检查血小板或白细胞增加；⑤异常的血细胞形态，在血液中出现不能解释的不成熟细胞，如多染色质的有核红细胞；⑥在炎症部位出现嗜中性粒细胞的左移；⑦有时为了检查肿瘤的进展情况，如淋巴瘤和肥大细胞肿瘤；⑧评价体内储存的量；⑨评价细胞溶解性骨损伤；⑩不知原因导致动物发热的疾病；不能解释的体重降低，不能解释的不舒服；确定高蛋白血症的原因，如继发于多发性骨髓瘤、淋巴瘤、黑热病、全身真菌感染；确定高钙血症原因。

二、骨髓评价方法概述

评价造血系统有多种方法可以选择，包括外周血细胞学检查，如全血细胞计数和分类计数、骨髓细胞涂片检查、股骨骨髓总细胞计数、骨髓切片组织病理学评价、骨髓细胞流式细胞仪分析、骨髓细胞培养等。

骨髓组织病理学和外周血细胞检查，在毒理学安全性评价研究中，是一个常规检查项目。应用常规方法制备骨髓细胞学涂片并保存，当发现血液细胞学计数发生改变和未确定病因时，评价骨髓细胞涂片。

骨髓组织病理学研究是一个主观评价方法，可以评价骨髓构造、评价细胞结构、评价骨髓粒系细胞与红系细胞的比例（不太敏感）、评价细胞祖系、评价铁贮存和其他特征，如肿瘤、炎症、色素、感染等。

骨髓细胞涂片评价和/或总股骨骨髓细胞计数，提供定量结果。比较好的细胞形态学可以测定骨髓粒系细胞与红系细胞的比例和骨髓细胞成熟指数。

成年犬的骨髓活检部位，一般选择在髂骨顶部、胸骨、近端肱骨、股骨大转子窝的沟处或肋骨等。股骨骨髓的中央腔一般被脂肪替代。在大鼠和小鼠体内，红细胞具有较高的转换率，由于它具有较短的循环半衰期，这意味着大部分骨髓腔空间仍保留成群的骨髓细胞。啮齿类动物的骨髓细胞也出现在胸骨和肋骨。一般骨髓采样部位选择在肱骨和近端股骨，不管动物年龄，在这些部位的骨髓仍保留造血活动。例如在Fisches大鼠，从4月龄到2年龄胸骨、肋骨、肱骨和近端股骨，大约68％仍具有相当类似的骨髓细胞结构；近端股骨和近端胫骨，大约61％骨髓细胞结构是类似的；不管年龄，远端胫骨显著缺乏造血活动。一般认为正常犬骨髓含有50％的脂肪和50％的造血组织，大鼠和小鼠大约70％到80％的骨髓是造血组织。犬的骨髓细胞分布占骨髓空间的20％～80％，依年龄和采集的方法不同而各异。Fisches大鼠，根据年龄和解剖部位不同，造血细胞所占的平均骨髓空间的变化在33％～88％。在该研究中，最年轻的小动物具有最高的骨髓细胞数，例如不管采集部位和平均骨髓细胞结构，在年龄为2个月龄时为80％，年龄在2岁龄时，细胞结构下降到平均的66％。

通常在脱钙、石蜡包埋、H-E染色的骨髓切片中，可以看到更多成熟期的红系细胞、粒系细胞、脂肪细胞、肥大细胞和巨核细胞。但是，同时可以观察到干细胞、不成熟骨髓红系、淋巴系、巨核系细胞和基质细胞，也可以评价造血活动和粒系/红系的比例。红系组分细胞较小，圆形、胞浆呈浓及深的嗜碱性颗粒、胞浆嗜碱性，随着它们的成熟减慢，嗜酸性也增加。粒系细胞具有大的蚕豆状核，具有较少的嗜碱性，胞浆比造血红细胞具有较多的小泡。巨核细胞容易辨认，它们的体积较大，具有较多的分叶核。在骨髓细胞涂片中，可以发现成熟淋巴细胞，而在脱钙、H-E染色的骨切片的骨髓中，淋巴祖系细胞的标志含糊且不容易辨认。

三、骨髓细胞涂片检查

骨髓细胞可以从暴露的骨髓获得，也可以从骨中挤出或用穿刺针采集。骨髓吸出活检技术有以下几个禁忌症：①注意在固定、镇静和麻醉动物时，产生的风险比活检程序中大；②血液稳态改变，导致活检后出血是一个潜在并发症；③活检采样后的感染是另一个并发症。但是，这些并发症均可以控制和避免。

一般将获得的骨髓加入同源血清或加入EDTA的生理盐水中湿化，制备涂片。骨髓吸出细胞学诊断，依赖于适当采集骨髓细胞标本及制备高质量骨髓细胞涂片。在大多数情况下，针刺活检只需要局部麻醉。有时，应用镇静剂并固定，活检部位去毛发、用抗菌剂消毒局部皮肤并进行局部麻醉；有时，需要全身麻醉，减少动物紧张的影响；在局部皮肤做一个小切口，使针头通过皮肤，进行骨髓穿刺取样。注意应用无菌针头和戴无菌手套。骨髓吸出要按时间安排实施，在同一时间进行。用于吸出骨髓的活检针头，一定具有一个可移出的探针，放在针头内，一直到针头插入骨髓腔内，以防止针头内径对皮质骨的破坏。应用16或18号针头，即长2.54厘米到3.81厘米的穿刺针头。当针头插入骨髓腔后，旋转针头，一旦确定针头在骨髓腔内时，移出探针，将一个12ml或20ml的注射器连接到针头上，注射器内最好含有几滴5％的EDTA抗凝剂，通过快速拉注射器的栓，使注射器内出现尽可能少的几滴血液，以减轻负压。完成采集后，快速移出，进行骨髓细胞涂片。如果注射器内没有抽出骨髓，换一个骨髓采集部位再次进行骨髓采集。

对于犬骨髓细胞涂片，应从犬的髂骨顶端、髂骨的冀部、胸骨、近端肱骨、股骨大转子窝的沟处采集骨髓细胞。犬的第3、4、5胸骨可用于活检骨髓细胞采样，但是，存在穿刺进入胸腔损害胸腔内结构的风险，故应该采用短的活检针头并谨慎操作，使针头在骨中央，控制出血，减少气胸，防止心脏破损。当获得骨髓细胞颗粒后，放在含有EDTA的生理盐水中，再将其放在载玻片上。骨髓颗粒为小的白色颗粒，在血污染的骨髓细胞吸出物中，应用吸管将骨髓吸出放在载玻片的一端，垂直放置，骨髓细胞颗粒附着在玻璃片上，而血液顺势流下。再放平载玻片，取另一个载玻片，交叉放在骨髓细胞颗粒上，垂直放于第一张载玻片，使其扩散成斑点，轻压、产生一个涂片。在没有加EDTA的骨髓细胞涂片的制备中，骨髓标本采集后，应立即涂片，一定要在几秒钟之内制备涂片。因为骨髓细胞会快速变性，特别是粒细胞，也可以应用从尸检前和尸检后采集的骨髓制备涂片。尸检时，应该尽可能快地采集骨髓标本（在几分钟内）。对于犬，应该在死后30分钟内，采集骨髓细胞标本。从死亡动物吸出的骨髓细胞，质量较差，骨髓细胞容易凝集，在吸出和涂片过程中，细胞容易溶解。如果从安乐死动物身上采集骨髓，建议动物用静脉注射巴比妥类麻醉，骨髓采集后实施安乐死。

用空气干燥涂片，然后应用Romanowsky-type染料染色涂片，如瑞氏、吉姆萨、Diff-Quik染色，染色时间根据经验确定，因为骨髓涂片比血涂片厚，至少比血涂片染色时间长1倍，确保适当染色。含有骨髓颗粒的涂片，具有蓝染的物质，肉眼可以看到。当镜检时，颗粒含有血细胞前体细胞和基质组分，应用乙醇固定，脂肪被溶解掉，在颗粒中表现出不同大小、没有着色的圆形区域。这也可用prussian染色铁，评价铁的贮存，此外，为了帮助区分白血病类型，也需要加入特殊染色。

福尔马林可能影响骨髓细胞涂片的染色质量，应该采取谨慎的态度，应避免在染色之前骨髓和骨髓涂片接触到福尔马林或其蒸气。

应用100倍目镜，评价骨髓细胞系和分类计数骨髓细胞。骨髓细胞分类计数，最好计数500个及以上细胞，但是，也可以应用较少的计数，如250个细胞的分类计数。骨髓细胞分类计数，应该根据细胞类型，如粒系、红系、巨核系、淋巴细胞系、巨噬细胞等来分类；也可以根据评价骨髓细胞分化时期，如原红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞，每类细胞所占的相对百分比来分类。此外，还要计算骨髓粒系细胞与红系细胞的比例和成熟指数。

四、骨髓细胞组织病理学评价方法

（一）骨髓标本固定

如果是从尸体采集骨髓标本，应该在动物死后，尽可能快地采集骨髓标本。固定溶液要通过交联蛋白质稳定组织，交联可以导致蛋白质变性，固定影响骨髓细胞形态学、细胞化学或标本的免疫组织化学评价的质量。它的优点是简单易行，一般应用10％中性福尔马林缓冲固定液。对于常规H-E染色的骨髓切片，在组织处理之前，不需要进行特殊处理。10％中性福尔马林缓冲液固定组织，可以应用于冰冻切片和脂肪细胞评价。对于免疫组织化学应用的标本，应用10％中性福尔马林缓冲固定液，长时间固定可能影响其评价，因为中性福尔马林缓冲固定液导致连续性氨基酸组的交联、蛋白质结构改变，最终导致抗原决定簇的丢失。在固定组织12小时之后，转移组织到70％乙醇中，可以减少固定相关的影响。

Zenker’s-type溶液（如Zenker’s 醋酸B5、Helly’s）是常推荐应用的固定液，常用于骨髓切片的固定。固定液现配，组织在固定之前冲洗，应用Litgol’s碘处理，以去除色素。骨髓组织固定1～2小时后，转移到酒精中，使组织变硬，长时间固定可以使组织变脆。当应用特殊染色时，组织中可能形成精细沉淀物（如银染色）。此外，固定液组分氯化汞是有毒的，并且容易通过皮肤吸收。以氯化锌为基础的Zenker’s固定液，具有类似于Zenker’s固定液的特征。Zenker’s类型的固定液，对于免疫组织化学方法是有用的，它们作为一个媒染剂，可以改善Giemsa染色剂对细胞核染色的细节。

Bouin’s固定液组织固定过夜，固定后水冲洗，在70％的乙醇中贮存，组织变硬和延长固定使组织变脆。苦味酸组分使组织染成黄色。因为Bouin’s固定液含有醋酸，具有脱钙作用，这个特性可以用于长期固定和定期换液（每周一次），它不能很好地保存精细形态学细节。但是，可以作为媒染剂，用于改善碱性胺蓝的染色。

（二）脱钙

对于石蜡包埋骨髓切片，在切片之前，一定要对骨髓标本脱钙。而对于树脂包埋标本不需要脱钙。有大量脱钙剂（如酸、络合剂、树脂）和方法（如沉浸、超声、微波、离子交换）适用于骨髓标本的脱钙。如果需要保存酶反应性和抗原部位，重要的是选择脱钙方法。

对于较大的标本，由于脱钙对组织形态学有些损害。这些损害是不可避免的，特别是应用酸脱钙剂时，有机酸和矿物酸是常用的骨髓标本脱钙剂，有机酸（如蚁酸和醋酸）比矿物酸（如盐酸和硝酸）脱钙慢，矿物酸是常用的快速脱钙的方法。用酸对组织过度脱钙，特别是矿物酸，可以导致组织破坏。因此，用酸脱钙的组织，不应该过度延长脱钙时间（如超过一周）。适当脱钙，使酸均匀分布在骨标本的周围，轻柔搅动脱钙液体使其分布均匀，如轻柔混合（如混合器或摇床）或空气起泡等均可应用。此外，为了适当脱钙，酸脱钙剂要求按一定时间换液（如每天）。通常，对于需要对酶或免疫染色的标本，不推荐酸脱钙剂。酸脱钙剂特别是矿物酸，均会下降形态学质量，使Giemsa染色丢失嗜碱性染色结构，有时会达到不能接受的程度。

络合剂，如EDTA，也是骨髓标本的常用脱钙剂，脱钙过程比酸慢。EDTA脱钙剂被推荐用于酶和免疫染色程序的标本脱钙。EDTA的作用依赖于pH值，如pH值越高，脱钙速度越快。因为高碱性pH也可以引起组织破坏和细胞内结构性物质的丢失，也影响酶和免疫染色的质量，所以，应用EDTA脱钙剂时，一定要避免pH值过高。

将骨标本放入有足够量的络合剂中，不需要更换溶液。络合剂脱钙剂可以单独应用或与沉浸、微波、超声或电解方法结合应用。对于沉浸技术，将骨标本放入室温环境的脱钙剂中，这是最慢的方法，但这只会引起最轻的组织损害。过度脱钙对H-E染色没有影响。

微波脱钙技术是应用微波炉，在容器内将组织侵入脱钙剂中。放入微波炉加热，脱钙过程被加速，特别是在应用矿物酸脱钙时。但是，加热容易损害组织标本，特别是在大于45℃时，可以应用70％的火力，20分钟间隔冷却，以减少热效应对组织的损害。当看到暗的骨髓组分、稀疏和污染的核时，可能与热损害有关。

超声脱钙技术，是将骨标本放入含有脱钙剂的超声机内，超声处理骨标本，脱钙速度加速，适合于H-E染色。可能的细胞学改变类似于应用微波方法处理的组织。

电解脱钙方法，是将骨标本放入一个脱钙剂中，放两个电极（阴性和阳性），通一个弱的电流，促进脱钙作用。该方法比浸入法稍快，染色比侵入法好。但是，该方法需要精心操作，不适用于大量标本，并要求频繁换液，可能会发生热损害。

离子交换脱钙方法，应用钙螯合树脂，结合酸脱钙剂。该技术比侵入法快，表现出比H-E染色组织状最佳的形态。将树脂放入容器底部，然后加入酸脱钙剂（典型的是有机酸如蚁酸），将骨标本浸入脱钙剂中。因为树脂螯合钙是不能用来确定终点的化学沉淀法的。树脂可以回收再用，不需要每天换液，由于树脂的来源和花费问题，该方法不适用于大量的标本。脱钙应该在较小容器内进行，回收的树脂要充分冲洗。

确定骨脱钙程度是一个重要步骤，过度脱钙可能导致组织破坏，脱钙不足又会导致差的脱水和渗透，最终影响切片质量。

X线检查法是最精确的方法，但是，需要适当的设备。此外，骨标本应用含有汞或其他金属盐固定液处理的标本，因重金属盐致使放射线不易穿透，X线不能应用。

化学沉淀方法（如草酸钙沉淀）是可靠且较容易的方法，适用于酸脱钙剂。这个方法也可以应用于EDTA脱钙的组织。机械弯曲或探针检查是一个主观评价方法，也是简单易行的方法。但是，此法不可靠，此操作可能干扰构造或移动软组织组分。也可以通过切片标本确定脱钙程度。

（三）组织处理和染色

对于石蜡包埋切片、H-E染色骨髓组织，是常规应用的组织学评价方法。但是，H-E染色不能提供造血细胞分化程度，这是因为切片厚度是一个重要影响因素。3毫米切片比厚的（≥5毫米）切片可以提供比较好的细胞形态学细节。Romanowsky染色的细胞形态非常好。Giemsa染色的切片比H-E染色更具有好的形态学细节，比应用Romanowsky染色涂片更容易。Giemsa染色，酸脱钙组织会导致嗜碱染色结构丢失。而应用络合剂类型的脱钙剂，可以改善Giemsa染色，应用树脂包埋，提供一个重要形态学改变，不需脱钙，减少浓缩、人工伪迹、脱钙相关细胞细节的丢失。容易制备薄切片（≤3毫米）改善细胞形态学质量，但是，包埋耗时、工作量大，花费大。应用普鲁士蓝染色，用于评价铁贮存，但是，脱钙剂或固定液中的酸可能冲洗掉铁，因此，组织铁可能被低估。

（四）骨髓标本切片的组织病理评价

骨髓是哺乳动物最大的器官之一，是重要的造血器官。因为造血系统是药物暴露的潜在靶器官，血液和骨髓评价是毒理学安全性评价的主要组成部分。骨髓组织切片的形态学评价，可以提供骨髓组织构造的信息，如细胞结构、细胞学、血管、基质改变、炎症、坏死等；也可以进行铁贮存的评价和其他特征的识别，如色素、感染、增殖或肿瘤等，结合全血细胞计数，骨髓组织学可以发现单独用外周血细胞检查不能发现的造血系统方面的改变。

骨髓对药物的反应，可能是该化学物的直接作用或它的代谢产物的作用或通过间接损伤其他器官系统或代谢通路，反映这些作用的骨髓损伤，这些，可以从石蜡包埋的切片中观察到。对于骨髓的各种各样的损伤，应该注意评价的一致性和标准化诊断术语。骨髓片的质量、结果解释等，受各种与标本采集和处理相关变异的影响，动物种类不同、标本采集部位、动物年龄也存在差异，要求同时针对对照组检查。

1．骨髓细胞发育紊乱——细胞数量增加

在骨髓组织切片中，有核细胞的增加表明对增加细胞需求的反应，在造血细胞中最明显，因为在H-E染色的切片上，不能明确地辨认淋巴细胞。造血细胞增加，如高细胞数、造血细胞增生或增殖，通过评估脂肪与造血细胞占骨髓腔的百分比以及同时与对照组动物的百分比值进行比较。在啮齿类动物，如果增生明显，造血细胞可能充满骨髓腔的空间，甚至通过营养孔道扩张。

在成年犬身上，当骨髓腔空间大于75％的部分被造血细胞占有时，应该被认为是骨髓增生。造血细胞增加，可能涉及所有细胞系（全细胞增殖）或个体细胞系。当仅涉及一个细胞系时，造血细胞增加，应该表明被影响的是某特定细胞系，如粒系或红系。此时细胞形态通常没有改变，成熟顺序是同步的。尽管有散在非典型细胞，如双核中幼红细胞、巨大叶嗜中性粒细胞、Howell-Jelly小体等。

根据受影响细胞系，也可能存在骨髓粒系和红系比例的明显转化。例如红系细胞增加，可能降低评估的骨髓粒系和红系比例。骨髓的其他细胞组分，如肥大细胞和巨核细胞，也可能在数量上有所增加。

在老龄大鼠骨髓切片中，也可以观察到肥大细胞的增加（肥大细胞增生病）。在大鼠和小鼠的骨髓切片中，观察到在巨核细胞内嗜中性颗粒的伸入运动，与给予生长因子或与慢性失血或炎症导致造血细胞活化有关。尽管组织切片可以提供受影响细胞系的证据，对于精确确定骨髓粒系和红系比例和成熟的同步性，必要时进行涂片或骨髓细胞离心涂片。

在大部分种属中，红细胞生成细胞的增加（红系增生），通常被认为是对贫血的一种反应，如失血的早期或溶血性贫血；也存在没有受影响的骨髓细胞增生（即高细胞数量）和成熟的同步。因此，可能存在原红细胞和早幼红细胞数量的增加，中幼红细胞和晚幼红细胞占优势。骨髓细胞分类计数证明骨髓粒系和红系比例下降是由于红系细胞数量的增加，在犬的骨髓切片中，红系增生发生于原发和继发性红血球增多症。骨髓改变在两种情况下是类似的，可能是红系和巨核细胞增加的高细胞数，也可能出现粒细胞增加，骨髓血铁质含量也可能下降。

在啮齿类的骨髓组织切片中，红系增生可能明显也可能不明显。增生的发展依赖于贫血的类型、时期、严重性及动物的年龄。在啮齿类的骨髓切片中，特别是在小鼠的骨髓切片中，红系细胞的增加经常在脾脏观察到，有时也在肝脏看到，它是对贫血的反应。

粒细胞生成细胞的增加（骨髓增生）经常与炎症反应有关。在组织学上，评估的骨髓粒系和红系比例增加和成熟同步，经常不受影响。尽管不成熟形式的增加，粒细胞占优势，由晚幼粒细胞和分叶粒细胞组成；随着急性炎症反应，骨髓分叶中性粒细胞数量，由于向外周血释放而下降。但是，可以看到粒细胞正常分布的骨髓增生和白血病反应样增生。由于粒细胞生成细胞的增加，定量骨髓细胞分类计数将证明骨髓粒系和红系比例的增加。

骨髓巨核细胞的增加，经常发生于血小板消耗增加或破坏增加的情形中。但是，巨核细胞增加，也可能发生在一些反应性贫血中。据报道，Balb/c小鼠，若每天腹腔注射聚乙二醇rHuMGDF两周，导致骨髓巨核细胞增生，粒系增生和红系细胞下降。在巨核细胞增生的情况下，可以观察到巨核细胞的高倍体；尽管骨髓粒系和红系比例没有改变，在骨髓细胞分类计数中，可以发现巨核细胞的百分比增加。

在H-E染色的组织切片上，很难发现骨髓淋巴细胞的增加。但是，有淋巴瘤时的情况除外。而在Romanowsky染色的骨髓涂片中可以识别出淋巴细胞的相对改变。

2．骨髓细胞发育紊乱——细胞数量下降

在骨髓切片中，有核细胞的下降，有几个描述性术语。如红细胞生成细胞损耗、细胞数降低、下降和萎缩。红细胞生成细胞下降，可以涉及所有细胞，即全血细胞减少或个体细胞系减少。在H-E染色的骨髓切片中，通过评估骨髓腔内红细胞生成细胞的百分比以及将这些发现与相应的对照组比较，确定红细胞生成细胞下降。当骨髓腔空间含有的红细胞生成细胞少于25％时，被认为是细胞减少。骨髓全细胞减少是指外周血全细胞减少和骨髓腔内由脂肪替代造血组织。一个细胞系被影响时，造血细胞下降应该表明涉及的祖系。当既影响粒系也影响红系时，骨髓粒系和红系比例改变。例如骨髓粒系和红系比例随红系细胞减少而增加，而随粒系细胞减少而下降；而且，存在同步成熟，有利于细胞后期的发育。此外，尽管组织学切片可以提供整个受影响的证据，但是，骨髓涂片或细胞离心涂片，对于精确评估骨髓粒系和红系比例和成熟的同步性仍是必要的，如成熟指数。

随着巨核细胞单纯性的下降，巨核细胞数量减少，可能存在有利于细胞发育和巨核细胞减少早期的成熟同步性，而骨髓粒系和红系比例没有被影响。从全血细胞计数观察到的再生性贫血，经常反映出与红细胞减少或抑制有关的骨髓红细胞生成细胞的下降。

据报道，骨髓内红细胞生成细胞的下降发生于以下情况，被认为是一种直接作用。如雌激素、氯霉素、抗病毒制剂、化疗药等；具有间接作用的药物如肿瘤坏死因子、硫酸铜等；此外，各种各样非骨髓条件如慢性炎症、肿瘤、营养不良、甲状腺低下、肾上腺皮质功能减退、慢性肾疾病或慢性肝疾病，均可以导致红系生成细胞的抑制。形态学上，骨髓切片可以出现低细胞数骨髓粒系和红系比例可能增加的情况，也可能出现成熟顺序向细胞发育的后期移动的情况。在与慢性炎症相关的贫血中，骨髓的细胞模式和红系细胞形态经常是正常的，但是，在染色时可见铁增加，骨髓巨噬细胞铁含量增加（血铁质），以及观察到作为H-E染色的金黄色/棕色色素或作为用普鲁士蓝染色的蓝色颗粒。这种骨髓铁含量的增加，可以用于区分慢性炎症性贫血与铁缺乏性贫血，缺铁性贫血时骨髓铁含量会下降。在慢性肾疾病性贫血时，骨髓可能是红细胞正常到低细胞性贫血。而在慢性炎症性贫血时，骨髓铁不增加。药物或化学物诱导的粒细胞生成细胞下降，出现的频率少于与红系相关的细胞。但是，它们发生于各种各样化合物中，包括化疗药物、抗生素（如氯霉素、先锋霉素）、抗高血压药物、保泰松、苯巴比妥和灰黄霉素。而与抑制骨髓产物相关的获得性血小板减少症，与各种各样药物如化疗药物、抗生素、抗炎药、抗惊厥药、雌激素等的使用有关。

先天或饮食限制引起的所有造血细胞的下降和明显增加骨髓腔中脂肪含量的细胞数下降，骨髓粒系和红系比例没有被影响。例如大鼠限制饮食到停止体重增加，引起红系、粒系、巨核细胞前体细胞分别下降至50％、40％、20％。

在另一个研究中，轻度（对照组的75％）和中度（对照组的50％）饮食限制两周，引起骨髓腔中央的脂肪明显增加，而骨髓的造血组织降低，造血组织的分布和表现仍没有出现明显改变。这些限制饮食研究，没有提供淋巴系细胞改变的信息。涉及所有造血细胞系的严重下降，被定义为骨髓萎缩、发育不全性贫血或发育不全性全细胞减少。在与药物相关的所有细胞系的降低中，它的特征是在骨髓中，所有造血细胞系的细胞数量中，以及血液中全血细胞减少。骨髓全细胞数的减少，不应该与以下情况混淆，如单纯性红细胞发育不全（仅红细胞生成被抑制）、骨髓组织生成紊乱（如骨髓纤维化和白血病）或骨髓增生异常（骨髓表现为正常或增生）。在H-E染色切片中，发育不良骨髓表现为缺乏造血细胞，主要由血管窦和脂肪组织构成，可以观察到散在的淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞和肥大细胞。在少数严重的病例中，可以发现小的、散在造血细胞岛。但是，在一般情况下，占据的骨髓腔小于25％，单纯红细胞发育不良作为一种红系前体细胞的严重降低，但是，全部骨髓细胞可能没有被影响，当粒细胞和血小板不受影响时，骨髓粒系和红系比例显著增加和血铁质增加。就大鼠而言，术语“萎缩”被应用于描述骨髓细胞数明显下降的骨髓损伤。它是一种不常见的、自发的、发生在成年大鼠身上，特别是发生在雌性大鼠身上的损伤，表现不具有临床意义。萎缩的特征是，单灶或多灶性损伤，由分界清楚的区域造血细胞的减少、增加或减少的脂肪细胞以及显著的网状基质构成。因为，在一些情况下，巨噬细胞数量增加，认为这种损伤和局灶性肉芽肿有一定关系，在老年大鼠或与处理有关的年轻大鼠，体重降低或增加，特别是在濒死大鼠身上，可以观察到弥漫性萎缩。

3．红细胞生成细胞异常

骨髓造血细胞紊乱涉及化学处理和营养不良，可能涉及个体细胞系（如异常红细胞生成、异常粒细胞生成、异常血小板生成）或细胞祖系的生成异常。异常红细胞生成，可以通过观察红细胞生成细胞的多核、核碎片、巨幼红细胞生成或环状成高铁细胞的生成来证实。

粒细胞生成细胞的特征，可能包括巨大形状、核低分叶或高分叶、奇怪的核型、核异常数目、异常大小或原始颗粒的特征。

血小板生成异常，可能由小的或大的巨核细胞构成，多倍体增加、出现小的分散的断片核。

术语“骨髓发育不良综合症”，用于描述一组或一个或多个细胞减少相关的一组紊乱。骨髓造血细胞发育不良性改变，趋向于发展为急性骨髓白血病，它难于与一些营养缺乏相区分，如VB₁₂、VB₆缺乏、难于与药物引起的发育不良区分，如铅、氯霉素。

犬的骨髓发育不良综合症，在骨髓切片上，具有以下特征：从正常细胞到细胞数量增加的情况下，骨髓粒系和红系比例增加，所有细胞均出现发育不良性改变。在骨髓涂片中，发育不良特征容易识别，而在骨髓切片上的特征不太清楚，包括一些改变，如早期红系细胞和/或粒系前体细胞数量增加，多核红细胞生成细胞或核叶/核极改变、红系细胞的巨幼红细胞改变、高铁红细胞生成、小的或大的低分叶巨核细胞、低或高分叶粒细胞前体细胞数量下降、大小和/或嗜酸颗粒的着色特征。

在慢性铁缺乏症中，骨髓切片的血小板发育不良，其特征为：细胞数量增加（与红细胞增生有关），骨髓粒系和红系比例小于1、晚幼红细胞缺乏胞浆、粗糙的细胞边缘、不一致的胞浆嗜碱性颗粒。此外，在铁缺乏骨髓中，缺乏可染着铁的高铁红细胞的数量下降。有些化学物（如铅）感染铁代谢和亚铁血红素/血红蛋白合成。在线粒体内，铁蓄积并能显示铁染色物。

红细胞前体细胞，含有铁的线粒体，在核内出现环状，被定义为“环状高铁红细胞”以及该损伤被定义为“高铁红细胞样改变”。

4．骨髓基质细胞改变

骨髓基质细胞损伤的诊断，包括基质细胞增生、骨髓基质细胞增殖、骨髓纤维化性骨髓营养不良和纤维化性骨损伤。这里描述的骨髓发育不良综合症，也应该归类在这类骨髓损伤中，因为脂肪细胞被认为是基质细胞群的部分；局灶性脂肪过多症，也被认为是基质细胞的改变。

（1）局灶性基质细胞增生

据报道，局灶性基质细胞增生偶尔在F344大鼠中观察到，其特征是难与局灶性萎缩相区分的小损伤。此外，在有些情况下损伤明显，含有暗淡空泡化的胞浆、圆形小泡状核和单一核的细胞。尽管核形描述不同，这种损伤，在组织学上类似于骨髓基质增生。

（2）骨髓基质增生

该术语用于分类F344大鼠一种罕见、不清楚的增殖性损伤，它被描述为未知起源细胞的散在性增殖，可能是基质网状细胞或组织细胞。该增殖的特征是不明显分界的、一般性的细胞群，具有丰富精细空泡化细胞浆，有时含有铁阳性染色的包含物，圆形到卵圆形式，稍有不规则的小泡状核、单一明确的核。存在一种银染色阳性的精细的网络，但是，三色染色阳性，围绕在细胞周围的基质，偶尔发现多核细胞。仅观察到少数、有些分裂的外形和小的或非细胞成分，这种增殖仅限于骨髓腔，可能是多中心、涉及轴向和长骨。这种损伤没有完全描述其特征，认为它不应该与骨髓组织细胞瘤混淆。通常，组织细胞瘤具有更多胞浆、多呈多形性、较少的胞浆空泡、丰富多核化的巨大细胞，涉及多个细胞，如肝脏、脾脏和肺脏等。

（3）局灶性脂肪过多症

这是一种脂肪组织的损伤，在F344大鼠中已有报道，其特征是在骨髓腔内，具有分界清楚的灶性成熟的细胞。脂肪细胞灶通常位于具有造血组织的骨髓腔中央，发现边缘接近皮质骨或接近骨髓端，造血细胞也可能散在分布在脂肪细胞中。在成年大鼠中，可能与正常分布的骨髓脂肪混淆，认为是一种自发性损伤，它的意义不清楚。

（4）纤维化

骨髓纤维化的特征是：胶原增加和增殖成为成纤维细胞或纤维细胞，造血细胞数下降，一定要与萎缩、基质增生、纤维化、骨发育不良区分。在年轻大鼠，观察到局灶性纤维化，可能继发于骨髓损伤、炎症、坏死等情况。

在实验动物种属中，术语“骨髓纤维化”被应用于描述骨髓的纤维化增生性损伤。例如，被应用于犬的骨髓纤维化性损伤。在实验室啮齿类动物中，暴露于放射线或感染鼠科白血病病毒，可导致骨髓纤维化性病变。在人类，骨髓纤维化是不确定病因的一种特异性骨髓增殖性紊乱，具有血液和免疫学异常，特征是骨髓再生障碍和纤维化。犬骨髓纤维化继发于多种原因的纤维增殖性反应，与丙酮酸激酶缺乏、γ 放射线、药物、感染、肿瘤等有关。在有些情况下，人类和上述描述的犬的情况类似。但是，大鼠的类似损伤与血液学和免疫学异常无关。对大鼠最好避免应用诊断术语骨髓纤维化，当观察时，应简单诊断这种损伤为纤维化。

（5）纤维骨化损伤和纤维骨化发育不良

尽管不是原发于骨髓损伤，纤维骨化损伤和纤维骨化发育不良是骨的纤维增殖性损伤，但是，在它们发展时，侵入并包围骨髓腔。在小鼠，它是一种特异的、自发性骨损伤，将它定义为纤维骨化损伤。特征是累积性骨髓空间纤维化性骨损伤，但是，不涉及血液学改变。在过去，损伤有各种各样的名称，包括纤维骨化损伤、骨肥大、骨髓纤维化，现在FOL分类为单独的实体，因为存在加速破骨细胞对骨的吸收与纤维空泡基质的增殖现象。在组织学上FOL类似于纤维骨化损伤。破骨细胞增殖后骨吸收，导致骨的形成与修复，新骨增殖导致小梁骨加厚、侵蚀骨髓腔中央，最后由小梁骨网络占据，通过纤维空泡基质分隔构成。

随着小鼠年龄增加，损伤可能占据骨髓腔空间的大部分（高达2/3），在FOL可能占据所有骨髓腔。但是，据报道，损伤大部分常见于胸骨、长骨和脊椎骨。这种损伤与增加血清碱性磷酸酶活性有关。但是，与原发和继发性甲亢无关。它是雌性B6C3F1小鼠常见自发性损伤，在一个研究中，可影响高达100％的老龄雌鼠，很少影响雄性B6C3F1小鼠，雌性小鼠早在32周龄就可以观察到该种自发病，FOL的病因学不清楚。但是，对于雌性倾向于认为改变性激素的状态。它是B6C3F1小鼠的一种自发性损害。

纤维骨化发育不良，也能用药物诱导该损伤，纤维骨化增殖模型类似于FOL。对大鼠给予化学物质或抗癌药物，可以观察到这种损害。某报道描述了它的特征，损伤为加速小梁骨增殖，增殖的细长细胞灶性或带状分布，侵蚀骨髓腔中央。当发生损伤时，保留的骨髓表现出正常或细胞数减少的情形，破骨细胞明显衬在不成熟交织骨上。

5．骨髓细胞变性改变

（1）坏死/变性

骨髓变性（如坏死）与化合物的给予有关，一定要与死后自溶改变或与处理相关的人工伪造相区分。

骨髓变性可能是由于与含酶丰富的粒细胞对酶颗粒的释放有关的自溶所致，以及标本固定差、固定速度慢和固定液渗透差所致。

巨核细胞是死后发生改变的第一种细胞，早期可识别的特征是巨核细胞核的浓缩。

骨髓梗死可能发生于干扰骨髓血液供应和一些其他情况如血栓或与肿瘤相关的血管阻塞。梗塞导致骨髓坏死，这是由于从粒细胞释放颗粒中的酶，损害可能是局灶性、多灶性或散在性的，其特征是造血细胞的胞浆空泡化、核固缩、核破裂、核溶解。

在受影响的骨髓中，细胞丢失，该区域被无定形颗粒、嗜酸碎屑替代且不应该与纤维蛋白沉积等混淆。在此种情况下进行纤维蛋白染色，对这种分类是有帮助的。随着时间的延长，在坏死组织内或附近，吞噬巨噬细胞数会增加。在急性情况下，坏死区可能充满完整的红细胞（由于损伤血管），在与陈旧性出血有关的骨髓区域的巨噬细胞内，发现血铁质色素，并被称为血铁质化。铁染色可以用于显示血铁质色素的出现。也可以观察骨髓出血，不与梗死/坏死相关的血管损伤/出血混淆，其特征是在脂肪和造血组织中，点缀完整红细胞湖。在犬，有血管窦扩张或异位的报道。在大鼠体内，已观察到骨髓严重减少的造血组织（骨髓毒性）。在小鼠，也发生继发于骨髓毒性的骨髓细胞丢失。

大鼠被严重限食两周（对照组的25％）后骨髓会坏死，包括造血和基质组织，基质细胞出现空泡化或坏死，也有造血组织的坏死，与对照组相比，存留的造血组织小于25％。主要由嗜中性粒细胞构成，许多表现出毒性、有局灶性出血、嗜中性粒细胞的侵入。

骨髓变性是用于描述严重的、动物常见的、非特异性改变，随着恶病质的进展，骨髓出现细胞数量下降；此外，存在的骨髓空间被浆液液体替代、脂肪细胞丢失的情况。局灶性变性、萎缩偶有报道，为老年大鼠和小鼠的自发性损伤。

（2）炎症性改变

在一般情况下，啮齿类和犬骨髓炎症性损害较罕见。局灶性肉芽肿性损害，其特征是巨噬细胞蓄积，有时候被吞噬的碎屑或胞浆内有残留物，具有卵圆形、加长的或纺锤状核，以及丰富的、暗淡的嗜酸细胞浆，可能与浓密聚集的单核细胞有关，在年轻和老龄大鼠中均有报道，而雌性大鼠比雄性大鼠多见。化学物引起的肉芽肿性炎症损伤、急性骨髓炎症，可以观察到败血症。骨髓急性炎症性损伤，它们可能由炎症细胞有关的纤维渗出物组成，具有嗜中性粒细胞的损伤，被定义为“急性骨髓炎”；没有嗜中性粒细胞的损伤，被定义为“纤维化骨髓炎”。在犬中骨髓肉芽肿没有报道。

炎症性改变的范围包括吞噬红细胞作用、淋巴细胞和浆细胞浸润。在免疫介导的贫血中，观察到吞噬红细胞作用。在健康犬骨髓切片中，可以观察到淋巴细胞聚集、浆细胞增加的情形，这被认为是慢性免疫刺激或骨髓瘤。

免疫球蛋白充盈的浆细胞，其特征是具有犬的桃红色到浅蓝色颗粒，定义为“火焰细胞”的浆细胞，其特征是淡红色胞浆位于周边，在患LgA骨髓瘤的犬中，可以观察到这种细胞。

在大鼠骨髓中，可以观察到淋巴细胞聚集或淋巴小结（具有发育好的生发中心），但是，在没有处理的动物身上很难发现。

（3）肿瘤形成

肿瘤分为原发性和继发性。在骨髓的原发性肿瘤，可以涉及造血细胞及血管内皮细胞；继发性肿瘤可以来自肿瘤的转移或局部侵入的肿瘤。

在骨髓中，肿瘤的组织学发现可以类似于其他器官。在肿瘤发展的情况下，它可以影响骨髓的正常构造。造血组织/脂肪组织可能被单纯的肿瘤细胞群替代。肿瘤细胞的特征取决于不同的肿瘤类型，而且，可以观察到与肿瘤有关的血管闭塞性的骨髓梗塞或坏死。

据报道在F344大鼠，骨髓造血组织的原发性肿瘤非常罕见，偶尔发现血管和连接组织的肿瘤。事实上，美国国家毒理学项目的历史数据库，均没有原发性骨髓肿瘤的报道。经常在大鼠中的组织细胞肉瘤被认为其起源不是骨髓部位，但是，骨髓表现为起源的原发性部位。

在小鼠骨髓，据报道，对于B6C3F1种系，血管肉瘤发生率大约为1％，而在雌性为0.5％，此外，雄性小鼠肿瘤和恶性肥大细胞肿瘤，在骨髓中的发生率相应为0.04％和0.24％，雌性恶性肥大细胞肿瘤的发生率为0.04％。

（五）骨髓空心针穿刺活检技术

骨髓空心针穿刺活检切片，为评价骨髓细胞结构、检测骨髓纤维化、骨髓内肉芽肿疾病及转移肿瘤提供了方法，比吸出骨髓涂片法更精确。

该技术的活检部位和动物准备，与吸出骨髓采集骨髓标本的技术一样。空心针穿刺活检技术，要求应用特殊针头及坚硬的芯中探头，7到13号骨髓活检针头，规格为7.62到10.16厘米。根据动物种属及大小，选择空心针穿刺针头。活检部位在额骨冀部、股骨头部及胸骨。

确定活检部位，并固定穿刺针头在该部位，在针头上实施压力，并顺时-逆时旋转，使针头进入骨内，移除探针，将针头进一步向前推进（顺时-逆时旋转），采集足够量的骨髓标本。一旦针头进入最大深度，做360°扭转并撤出，将针头内的核心活检材料用一个金属丝推出。骨髓标本被固定、脱钙、包埋、切片、H-E染色或其他染色，进行骨髓切片的组织学检查。此外，可以应用刚拔出的空心针活检针头进行骨髓细胞涂片，针头顶部轻柔地在载玻片上滚动，与吸出骨髓涂片的染色方式一样进行染色处理。这种制片，质量较差，特别是巨核细胞数量和可染色铁的数量通常较低。

（六）骨髓细胞形态学识别

吸出骨髓细胞涂片，应用瑞氏-吉姆萨染色，细胞形态学表现良好。但是，空心针活检材料切片及组病理学切片，应用H-E染色，肉眼观察时，骨髓颗粒表现为蓝染区域，当用显微镜检查时，它们含有血细胞前体细胞、血管内皮细胞、网织细胞、巨噬细胞和浆细胞。用乙醇固定期间，脂肪被溶解掉，出现不同大小、没有染色的圆形区域。正常动物的大部分骨髓颗粒由2/3的细胞组成。

1．巨核细胞系列

巨核细胞系列是最容易识别的细胞，它们具有单一核、深色嗜碱性胞浆。

在大部分正常吸出骨髓的细胞涂片上，这个细胞类型不易识别，因为它仅出现少数细胞，难与其他母细胞区分。早幼巨核细胞，具有2个或4个核深色嗜碱性胞浆，容易识别。这些细胞比白细胞、有核红细胞前体细胞大很多。后者核复制导致进行性增大的嗜碱性巨核细胞，嗜碱性巨核细胞中的核加入分叶块中，使它难于计数核复制的数量。洋红染色胞浆颗粒的合成，使得粉红色增加，成为成熟（颗粒）巨核细胞的胞浆特征，巨核细胞直径巨大，从50nm到200nm，具有较大核体的细胞。

2．红细胞系列

随着红细胞系列的成熟，细胞形态会发生改变，如体积减小、细胞核与胞浆的比例下降、进行性核浓缩。随着血红蛋白的合成和在胞浆内的蓄积，胞浆颜色会变红。

（1）原红细胞

原红细胞是红细胞中相对较大的，且有高的细胞核与胞浆的比例、浓的嗜碱性胞浆，是因为出现许多聚合糖体。原红细胞的核接近完美的圆形，染色质的量是精细的颗粒，含有一个或两个轻度蓝色到中度蓝的核。(www.xing528.com)

（2）早幼红细胞

早幼红细胞已看不到核，可以见到稍微粗糙的染色体凝块，细胞核与胞浆的比例稍微小于原红细胞。

（3）嗜碱性中幼红细胞

该类型细胞具有蓝色胞浆，但是，比早幼红细胞小，具有较低的细胞核与胞浆的比例，核浓缩成鲜亮和暗色区域，使核成为车轮状。

（4）嗜多染色中幼红细胞

血红蛋白（红色）和核糖体（蓝色）两者均会出现，可以解释嗜多染原红细胞粉红色、蓝色胞浆的特征，趋向于比嗜碱性原红细胞较少，具有更多浓缩核。

（5）晚幼红细胞

该细胞较小，核呈暗色（固缩状），少数或无透明区，胞浆是嗜多染区，可能是正常染色质。

（6）嗜多染红细胞（网织红细胞）

当晚幼红细胞丢失核后，形成网织红细胞，表现为嗜多染红细胞，随着连续血红蛋白的合成和核糖体丢失，导致胞浆染红的成熟红细胞形成。

3．粒细胞系列

随着粒细胞系的成熟，形态学发生改变，包括体积稍微减小、细胞核与胞浆的比例下降、进行核浓缩，核型改变，胞浆内出现颗粒，在从原粒细胞发育到成熟粒细胞的过程中，胞浆颜色会发生改变，从灰-蓝色到亮蓝色，到接近于无色。

（1）原粒细胞

该细胞有两个类型，类型Ⅰ原粒细胞，为大的圆形细胞，圆形到卵圆形核，通常位于细胞的中心，细胞核与胞浆的比例高（大于1.5），核轮廓规律、光滑，染色质有精细的点彩，含有一个或更多个核或核环。胞浆，通常为中度嗜碱性（灰色-蓝色），不如原红细胞暗；原粒细胞到晚期幼粒细胞形成，这些细胞中的一些可能含有（﹤15）小细胞，胞浆有洋红染色的颗粒，这些细胞被分类为Ⅱ型原粒细胞。

（2）早幼粒细胞

胞浆内一旦有大量洋红染色，在胞浆内可以发现原代颗粒，该细胞被分类为早幼粒细胞。尽管在一些早幼粒细胞内可以看到核或核环，其他没有显示出核结构，早幼粒细胞可能稍微大于原粒细胞，它们具有更丰富的胞浆。

（3）中幼粒细胞

在胞浆内，不再能看到早幼粒细胞特征的原代洋红染色颗粒。在这个时期，出现描述为嗜碱性粒细胞的特征性后生颗粒。中幼粒细胞具有圆形核，但是，通常较小或含有更浓缩，比中幼粒细胞具有更加亮-蓝色的胞浆。在嗜中性中幼粒细胞内，很难看到后生颗粒，它们具有嗜中性染色特征。嗜酸性中幼粒细胞和嗜碱性中幼粒细胞，可以通过它们的特征性颗粒识别。

（4）晚幼粒细胞

一旦核呈锯齿状和明显浓缩，前体细胞不再分化。具有肾形核的前体细胞，称为晚幼粒细胞，轻度锯齿状核，延伸进入核少于25％，该核仍被分类为原粒细胞。与原粒细胞一样，晚幼粒细胞颗粒在染色特征上，可能是嗜中性、嗜酸性或嗜碱性细胞。

（5）杆状细胞

具有轻薄的、杆状、平行核的细胞，叫做杆状细胞。核在胞浆内扭曲适合该空间，常见于梯形或S形核。

（6）分叶粒细胞

粒细胞发育的最后时期是分叶或成熟的粒细胞，在这些细胞中，核膜不再光滑，核变得不规律，分叶成为2个或更多个叶，核染色质中度浓缩为凝块，背景胞浆通常是无色。但是，在嗜中性粒细胞内，可能出现微弱的蓝色或粉红色。嗜酸性和嗜碱性细胞的核比嗜中性粒细胞的核通常具有较少的分叶、胞浆中有特征性颗粒。

4．单核细胞系列

单核细胞系列由原单核细胞、早幼单核细胞和单核细胞组成。它们在骨髓总细胞数中占有较小比例，不易与早期粒细胞系细胞区分，有大量洋红染色的颗粒。原单核细胞类似于原粒细胞，它的核型呈不规律的圆形成盘状；早幼单核细胞外形类似于中幼粒和晚幼粒细胞；骨髓单核细胞与外周血看到的一致。

5．巨噬细胞

巨噬细胞指具有丰富胞浆，核为圆形、卵圆形，具有精细凝块染色质的大细胞。胞内通常含有空泡和吞噬物质，如固缩核碎片、血铁质、罕见红细胞和白细胞。在巨噬细胞内的血铁质，在用常规血液染色时，表现为灰色到黑色。尽管有核红细胞前体细胞在中心巨噬细胞周围发育，这些原红细胞岛罕见于吸出骨髓涂片。因为，它们在吸出期间和涂片期间容易被干扰。

6．淋巴细胞

淋巴细胞的生成，通常发生在骨髓内，随后，出现低数量原淋巴细胞和早淋巴细胞，它们难与原红细胞和早幼红细胞区分。大部分骨髓淋巴细胞是小的，形态学与血液中看到的一致，也可以出现反应性淋巴细胞。

7．浆细胞

浆细胞是较大的细胞，具有较低的细胞核与胞浆的比例，具有比静止淋巴细胞大的胞浆嗜碱性颗粒，胞浆内出现明显的高尔基体，产生一个核周的暗淡区域。它们典型地具有古怪的定位的核、粗糙的染色质凝块，有浆细胞胞浆内，罕见有略带桃色或蓝色包涵体（Ressell小体），这些包涵体内含有免疫球蛋白和其他糖蛋白的粗面内质网。这种现象表现出处理或转运这些蛋白质缺陷的结果。浆细胞充满Ressell小体，一些浆细胞的胞浆，染成粉红色，特别是在外周细胞，这些浆细胞称为“火焰细胞”。

8．破骨细胞

破骨细胞是吞噬骨的多核巨大细胞，在组织学切片观察时，它们紧邻成骨细胞表面，破骨细胞可能与巨核细胞混淆，但是，破骨细胞的核是单独的，与巨核细胞中出现的融合性核相比，胞浆染成蓝色，经常含有不同大小的洋红染色颗粒物质，它与骨的移除和消化有关。破骨细胞在从成年动物吸出骨髓的涂片中罕见。但是，它们可能出现在骨溶解增加的紊乱时，如恶性高血钙血症、破骨细胞在骨重建活动的生长期、动物吸出骨髓的涂片中。

9．成骨细胞

相对较大的细胞而言，成骨细胞具有古怪的核和泡沫状嗜碱性胞浆，在胞浆中央部分，可以看到一个明显的高尔基体区域，成骨细胞外表类似于浆细胞。但是，它们具有较大的和具有较小浓缩的核染色质。成骨细胞核呈圆形和卵圆形，具有网织状染色质，可能具有一或两个核。成骨细胞经常发生在带小梁骨表面的衬里层。

10．分裂象

骨髓在任何时间内，均主动产生新的血液细胞，但是，分裂象是细胞循环的一个简短部分，通常所占比例不到2％，有些有丝分裂细胞的起源，通过胞浆特征识别，例如颗粒或血红蛋白出现。

11．各种各样细胞和无核细胞

在吸出骨髓细胞和涂片期间，血管和连接组织通常破裂，尽管可以看到低数量的完整细胞，但是，在骨髓吸出涂片中，基质细胞在成骨不全的骨髓中更明显，破碎的基质细胞是骨髓涂片上发现的无核细胞。无核细胞也来自各种其他骨髓细胞，特别是在骨髓凝集时的涂片上，在这种薄涂片中，破坏细胞来自晚幼红细胞的无核细胞称为蓝细胞。术语“蓝细胞（basket cell）”用于描述在一个花边状染色质散布的无核细胞。

在骨髓涂片上的脂肪细胞，大小不同，数量也不同。尽管正常骨髓含有多种脂肪细胞，但这些细胞在标本采集和涂片过程中易破碎。脂肪细胞表现为在骨髓颗粒中有大的空泡，在涂片固定过程中脂肪被移除。在骨髓中产生肥大细胞的前体细胞，但是，成熟肥大细胞在正常骨髓中罕见，肥大细胞是圆形细胞，具有圆形核，典型的特征是在胞浆内有大量紫色颗粒。

（七）骨髓涂片检查考虑的要点

①骨髓涂片质量，计数细胞的可变性（变异）；②外周血液细胞计数是否存在骨髓毒性的证据；③在组织学骨切片上是否存在骨结构改变的证据；④该效应是否仅限于一种或多种细胞系；⑤该效应是否继发于其他器官的毒性；⑥是否该骨髓结果表明是一种恢复的反应；⑦是否存在基质细胞毒性。

（八）骨髓空心针穿刺活检技术吸出骨髓标本的操作规程

1．目的

应用骨髓吸出针头，制备骨髓吸出涂片，以便客观镜检染色吸出涂片的情况。

2．程序

（1）带有探针的18号骨髓穿刺骨髓吸出针头，调整防护装置，确定插入深度。

（2）应用EDTA作为抗凝剂，采集骨髓吸出物，推入培养皿中。应用吸管从培养皿中采集用于制备涂片的骨髓颗粒。

（3）将从培养皿采集的骨髓颗粒，放在玻片的一端，然后垂直放置载玻片，骨髓颗粒黏附在载玻片上，而污染的血液顺势流下来。

（4）将第二个载玻片交叉放在黏附骨髓颗粒的上面，正交于第一张载玻片。使载玻片黏在一起，施压，使骨髓颗粒展开，然后，在水平方向迅速拉离，利用空气干燥涂片。

（5）应用瑞氏-吉姆萨染色两张涂片，在涂片顶部缺乏蓝染物质，表明仅有少数骨髓颗粒。在涂片底部有丰富的蓝染物质表明有大量骨髓颗粒。

（6）以从犬采集的正常骨髓吸出物涂片为例，存在没有被染色的圆形区域，具有不确定的大小，它是骨髓涂片在乙醇固定期间脂肪被溶解掉的地方，出现的大细胞是巨核细胞，应用瑞氏—吉姆萨染色。各种动物的细胞核与胞浆的比值如下：小鼠股骨为1.49（0.8～2.4）；大鼠股骨为1.25，大鼠肋骨为1.40；比格犬胸骨为1.66，比格犬肋骨为1.0～1.7，比格犬股骨为0.75～2.53；猴胸骨为1.37，猴脊椎骨为1.36，猴肋骨为1.28，猴股骨为1.11。

五、强化的骨髓组织病理学检查

（一）简介

骨髓病理检查是指在动物尸检时，采集胸骨、脊椎骨或股骨处理，为了评价骨髓细胞结构，制备脱钙骨的常规固定、石蜡包埋、切片及H-E染色。在采集标本的同时，采集骨髓内的脱落物涂片，并进Romanowsky染色备用。

H-E染色的骨髓组织与切片，难于辨认淋巴系细胞，在检查H-E染色的切片期间，如果发现细胞改变，定性和定量评Romanowsky染色的骨髓涂片。因为，它可以提供高质量的细胞形态学和细胞成熟阶段的信息。

H-E染色组织切片的评价，可以作为骨髓组织毒理学开始的筛选检验、评价细胞密度、粒系/红系比值、巨核细胞、脂肪细胞、基质细胞数量的增加或减少、检测血铁质量。此外，也可以发现骨髓坏死、出血、纤维化、肉芽肿、肿瘤的出现及严重性。

尽管最好的检测指标是淋巴细胞群的改变，但是，淋巴祖系细胞难于与H-E染色骨髓的其他许多有核细胞区分。如果骨髓粒系与红系比值出现改变，那么，骨髓涂片的细胞分类计数可以用于确定哪个细胞系发生了改变，可以定量评价这种改变。随后，流式细胞仪可以提供定量和关于造血免疫细胞表型的信息，以及淋巴细胞形成细胞群的信息。

（二）粒系/红系细胞比值

粒系/红系细胞比值是粒系细胞和红系细胞的相对比值。在大部分动物种属中，粒系/红系细胞比值通常具有轻度增加趋势，粒系/红系细胞比值的改变，可能是由于粒系或红系细胞的改变所致。全血细胞计数与H-E染色切片上粒系/红系细胞比值的比较，对区分哪一种细胞类型在增加或减少可以提供一些有用信息。

（三）成熟指数

成熟指数是指骨髓内增殖期细胞与成熟期细胞的比值，在哺乳动物中这个值典型地表现为1∶4，该值可以帮助更清楚地确定造血缺陷的性质，为了确定是否改变细胞成熟模式，一定要仔细检查骨髓组织学和细胞系。骨髓组织涂片的分类计数，可以较好地确定造血异常的性质，对于粒系细胞，增殖期细胞是原粒细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞和晚幼粒细胞。骨髓检查清单应该包括：①骨髓细胞损害程度的分级打分（如打分0分为正常、1分为最轻、2分为轻度、3分为中度、4分为明显）；②细胞增加或减少，评价的骨髓细胞包括粒系细胞、红系细胞、巨核细胞、脂肪细胞、网织外膜细胞、巨噬细胞、粒细胞分型；③血铁质增加或减少；④坏死；⑤出血；⑥纤维化；⑦肉芽肿；⑧粒系/红系比值；⑨其他异常。

六、骨髓造血祖细胞体外培养

（一）概述

实验动物和人类的造血系统对许多药物的毒性作用特别敏感，如氯霉素、氯喹、青霉胺、白消安、氯金酸钠等，暴露于这样的制剂可能带来严重的血液学损伤后果。体外骨髓培养检验，在评价动物和人类的造血干细胞和祖细胞群对毒性和损伤方面，是一个有用的方法。应用于人、小鼠、大鼠、犬的骨髓干细胞和祖细胞的定量培养已有较多报道。

有人应用长期骨髓培养研究了骨髓毒性药物苯丁酸氮芥的骨髓毒性，已经建立大鼠股骨骨髓的长期培养的最佳化条件。此外，还开发了短期培养方法，定量培养大鼠的定向造血祖细胞，其应用的造血细胞因子和生长因子可以获得商品化产品。

体外方法更快、更经济，而且提供的数据可以解释或阐述毒性效应的机制、药物或化学物的骨髓抑制，骨髓毒物影响特异造血干细胞或影响造血微环境，而产生毒性效应。可以应用短期和长期骨髓培养试验，识别这些效应，方法有红细胞集落形成单位（CFU-E）、粒细胞/单核细胞集落形成单位（CFU-GM）、巨核细胞集落形成单位（CFU-MK）和粒细胞、红细胞、巨核细胞、单核细胞集落形成单位（CFU-GEMM）。这些实验方法已经被建立并被标准化，有些方法已经用于骨髓毒性药物的评价。

在临床前安全性评价中的体外骨髓毒性试验，最好与体内试验相结合，以提高预测价值，这对于抗癌药物和抗病毒药物特别有用，以便确认弱骨髓抑制类似物、结构-毒性关系和候选新药。体外骨髓干细胞实验，还能够检测药物的代谢物和对血清及其他细胞成分（如淋巴细胞）的效应；最重要的是可以直接检测人类造血干细胞对骨髓毒性药物的反应，因此，避免了外推因素的影响。

（二）大鼠骨髓造血祖细胞体外培养

1．骨髓细胞采集

在大鼠腹腔注射戊巴比妥钠溶液，实施安乐死，应用Iscoves修改的Dulbecco’s培养基（IMDM），加10％胎牛血清，冲洗左侧和右侧股骨，每侧应用该培养基5ml。

2．长期骨髓细胞培养

（1）应用加入10％胎牛血清的IMDM培养基，制备骨髓细胞混悬液，应用血细胞计数板计数细胞浓度，应用苔酚兰细胞排斥法计数细胞。

（2）调整IMDM培养基的渗透压到340毫渗透压，加入10⁶mM琥珀酸氧化可的松、1％谷氨酸、100单位的青霉素和链霉素、20％胎牛血清。

（3）应用上述培养基调整骨髓细胞到12×10⁶细胞/ml，建立长期骨髓细胞培养。细胞培养在6孔培养板上，双孔或不加重组小鼠干细胞生长因子100mg/ml，或加重组小鼠干细胞生长因子100mg/ml，培养在33℃，5％CO₂的环境中。

3．集落形成单位细胞检验

每间隔一周，将50％的非黏附细胞，从长期骨髓培养中移除，应用新鲜培养基替代包括重组大鼠干细胞因子或重组小鼠干细胞因子，或两者均不加。非黏附细胞应用台盼蓝细胞排斥法计数活细胞，在含有30％胎牛血清、1％牛血清白蛋白、10⁻⁴巯基乙醇和0.9％甲基纤维素的1ml IMDM培养基中，培养10⁵个细胞，培养在直径为35mm的培养皿中，应用双皿。随后，每皿加入生长因子、4个单位重组人红细胞生成素、50mg重组小鼠白细胞介素-3、50mg重组小鼠干细胞因子或50mg重组大鼠干细胞因子、50mg重组人白细胞介素-6、50mg重组人粒细胞集落刺激因子。骨髓细胞培养在37℃、5％ CO₂的环境下，培养14天。

4．计数粒细胞-巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）、红系细胞爆式形成单位（BFU-E）、含粒细胞-巨噬细胞和红细胞组分的集（CFU-GEM）、将CFU-GW、BFU-E和CFU-GEM的数量加在一起，计算每皿的集落形成单位细胞（CFU-C）的总数。

（三）小鼠红系祖细胞体外培养

1．研究目的

检测骨髓造血功能。

2．程序

（1）小鼠骨髓采集

将小鼠用乙醚麻醉，从股骨头大转子和股骨处截断，剥离双后肢股骨，去除股骨上附着的肌肉，用注射器吸取RPML 1640培养液，冲洗出骨髓细胞，通过4号针头过滤。

（2）CFU-E培养体系

骨髓细胞2×10⁵/ml、小牛血清30％、小牛血清白蛋白10％、二巯基乙醇1×10⁵mol/L、甲基纤维素40％、红细胞生成素、RPML 1640培养液20％。

（3）培养条件及方法

将培养体系加入培养皿中，轻轻摇匀，加盖后，在倒置显微镜下观察，应使骨髓细胞均匀分布，不聚集成团。然后，将培养皿放入CO₂培养箱内（37℃、5％ CO₂）、在饱和湿度下培养48小时。

（4）结果判断

CFU-E集落为8～50细胞组成的细胞团，凡超过8个细胞的红系细胞集落为一个灶，每一个灶代表一个红系祖细胞。

（四）小鼠粒系祖细胞体外培养

1．研究目的

检测骨髓粒系造血功能。

2．程序

（1）将小鼠用乙醚麻醉，剥离双后肢股骨，去除附着肌肉，从股骨头大转子和髂骨处截断，用注射器吸取RPMI 1640培养液，冲洗出骨髓细胞，通过4号针头过滤。

（2）培养方法（双层培养法）

在直径35mm培养皿内的0.5％琼脂中，加入2.0mm³大小的小鼠肺组织块3块，待琼脂凝固后，加入含有40％马血清、40％的0.3％琼脂及20％ RPMI 1640培养液、1×10⁵骨髓细胞，培养体系总体积为1ml，放入CO₂培养箱内，培养条件为37℃、5％ CO₂、在饱和湿度下培养7天。

（3）结果判定

在倒置显微镜下计数集落数，CFU-GM培养7天，在低倍镜下，可以看到集落细胞团有三种类型：致密型、疏散型、混合型。规定在琼脂皿中40个细胞以上的细胞团为集落，每一个灶代表一个CFU-GM集落。

七、骨髓细胞流式细胞仪分析

（一）目的

流式细胞仪散射分析结合特异性单克隆抗体评价犬骨髓的增殖紊乱；流式细胞仪散射图分析，用于确定成熟、不成熟粒系和红系细胞。应用四个单克隆抗体标志细胞，确定不成熟粒系细胞的细胞免疫表型。

（二）程序

1．犬骨髓标本采集和处理

用注射器将骨髓吸入用2％ EDTA溶液冲洗过的注射器中，立即制备涂片，剩余标本冷冻或在2小时内处理，80μl骨髓标本放入6ml无菌塑料管中，加入2ml红细胞裂解缓冲液，含有0.5％多聚甲醛，室温放置10分钟，离心，细胞沉淀物用含有1％羊血清和2mM叠氮钠Dullbecco氏磷酸缓冲盐溶液冲洗，并重新混悬在700ml无菌试管中，先前研究表明无核红细胞能被这个操作程序裂解。100μl细胞混悬液7个6ml无菌试管的每一个之中，试管与四个单克隆抗体之一或与不相关同型匹配，对照抗体孵温；抗体包括抗-CD-18，anti-thy-1，抗主要组织相容抗原Ⅱ型抗体，抗-CD-14，抗-CD-14抗体与藻红蛋白-Cy5结合，犬骨髓这些抗体染色特征，通过应用荧光活化细胞资料，已经被描述在室温孵育60分钟之后，细胞应用含有1％羊血清和2mM叠氮钠的Dullbecco氏磷酸缓冲盐溶液冲洗，并重新混悬在100ml中，除样品与抗-CD-14孵育之外，样品用20μl 1∶20稀释的荧光剂连续的羊抗小鼠IgG孵育，或与大鼠IgM孵育30分钟，此后，样品稀释到1ml，并在2小时内分析。

2．流式细胞仪技术

应用一种FACs Callbur 流式细胞仪进行流式细胞仪分析。对于所有样品，通过forward-angle与side-angle 先散射特征显示细胞群，正向散射设置在0.1A，侧向散射设置在444V，功设在9.54，荧光强度设在425。正向散射阈值设置在50，以排除血小板和小的特殊碎屑。每个骨髓标本分析总共30 000个细胞，应用先前开发的细胞分类计数的模板，评价散射图。这个模型能够识别成熟和不成熟红系细胞，以及识别成熟和不成熟粒系细胞。记录每个通道内的细胞百分比；应用第二个散射图X轴和Y轴荧光强度，分析每个通道内的细胞；应用X轴上的绿荧光强度和Y轴红荧光强度散射图，分析双标记标本。从一些骨髓样本来源的荧光细胞支持正向斛与侧向斛散射。