流感病毒检测简便有效

（一）核酸检测

流感全名为流行性感冒，是由流感病毒在人群中广泛传播，从而引起的一种急性呼吸道传染病，历史上曾发生过多次流感大流行。有相关资料表明的流感大流行出现过5次，大约感染了数亿人，其中也导致了数千万人死亡。而且这5次大流行均波及全世界多个地方（见表3-53）。在这几次大流行中，以“西班牙流感”造成的后果最严重，至少夺走了全世界4000多万人的生命，我们国家在这次流感中也付出了惨重的代价。

表3-5　流行性感冒波及地区情况

流感在我国已知的三类传染病中属于丙类传染病。从国家最新颁布的治疗方案《流行性感冒诊疗方案（2020年版）》中可知，部分病毒每年会呈季节性流行，全国流感的监测也显示每年10月我国会进入流感的高发时期。在任何一个特定的年份，部分流感病毒种类可能会灭绝，而另外一部分流感病毒种类则随着时间的推移而生成或者和其他种类的病毒混合生成新的病毒从而导致大流行。虽然接种流感疫苗能在一定程度上控制疾病的传播，但一旦出现病毒的变异，在人群普遍易感的情况下，很大程度会再次出现大流行，它给人类社会带来的灾难是有目共睹的，对于流感的监测意义重大。

流感病毒核酸检测，有助于早期诊断和鉴别诊断。RT-PCR方法直接监测患者分泌物中的病毒RNA，不但简便、快速，且较培养法及其他免疫测定方法检测特异抗原和抗体更敏感。流感的早期症状与其他呼吸道病原体感染、流行性乙型脑炎、军团病和支原体肺炎等相似，因此，实时荧光RT-PCR法是早期诊断和鉴别诊断的最佳方法之一。此外，流感病毒核酸检测还有助于患者隔离与治疗，对于某些传染性较强的流感病毒感染，能明确诊断后，及时对患者隔离，并尽早开始抗病毒药物治疗，这对于防治并发症、降低病死率和改善预后，具有重要意义。

图3-53　流行性感冒病毒形态图

流感病毒属于正黏病毒科的一种单股、负链、分节段的RNA病毒，呈球形或者丝状，直径在80～120nm，个别的丝状病毒长达400nm甚至是数微米，一般这种长丝状的病毒常见于刚分离到的病毒颗粒。病毒的结构分为三层，包括核心、基质蛋白和包膜，最外层的包膜为双层类脂囊膜，这层结构来自复制的宿主的细胞，外层囊膜上附着着许多长为12～14nm的纤突，每个病毒大约覆盖了500个纤突，其中有两种重要的纤突：第一种是能凝集红细胞的棒状突起，称之为血凝素（HA），是由三聚体的血凝素分子构成，其功能是使病毒结合到宿主细胞并与之融合，释放核衣壳进入胞质，并且能诱导产生保护性中和抗体；第二种是能使病毒从凝集的红细胞表面释放的蘑菇状突起，称之为神经氨酸酶（NA），是由四聚体的神经氨酸酶分子构成，其功能是可以清除病毒表面和感染细胞表面糖蛋白末端的唾液酸，阻止病毒聚集，协助子代病毒从感染细胞中释放，使抗体不能中和病毒，并可以控制病毒的释放，将有效地缩短感染的过程。两种突起在囊膜上的比例约为75:20，两种突起以疏水性氨基酸为辅助固定在类脂膜上，中间层为基质蛋白（M），它是一种跨膜蛋白，位于囊膜的内侧面，是流感病毒的主要结构蛋白，也是维持病毒形态的结构蛋白。囊膜上还存在着另外一种蛋白称之为M2蛋白，是一种四聚体，M2蛋白在病毒内外形成一个质子通道，在对HA合成和病毒脱壳过程中提供低pH环境起着重要的作用。核衣壳呈螺旋对称，直径9～15nm，包含核蛋白（NP）、三种多聚酶蛋白包（PB1、PB2、PA）和病毒的RNA，RNA分为8个不同的片段，编码聚合酶蛋白（PB1、PB2、PA）、血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、核蛋白（NP）、基质蛋白（M1和M2）和非结构蛋白（NS1和NS2）等10种蛋白质，囊膜下的核蛋白（NP）包裹着RNA分子，其3'与三种RNA聚合酶（PB1、PB2）和PA分子组成的核糖核蛋白复合物（RNPs）相连，形成一个或多个球形的蛋白壳。非结构蛋白（NS2）和核输出蛋白（NEP）在未拼接的RNA分子从宿主细胞核内到细胞质的运输中起着重要的作用，并与M1相连。这当中具有抑制干扰素作用的非结构蛋白NS1，在感染的细胞中比较丰富，但没有装配到病毒的结构中。

图3-54　流行性感冒病毒结构蛋白图

流感病毒根据其特异的核蛋白和基质蛋白（M1），可分为4个不同的型，甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒和丁型流感病毒。其中乙型仅对人致病，丙型能对人和猪致病，丁型可感染猪、牛，尚未有感染人的报道，甲型可对人、猪、马和禽致病，现已知的所有亚型的甲流病毒都可以在鸟类水禽中存在。目前，甲型流感病毒根据两个外壳糖蛋白即血凝素和神经氨酸酶的抗原性不同，又可以分为17个HA（H1～H17）和10个NA（N1～N10）亚型。甲型流感病毒已知感染人的亚型有17个（见下表）：

表3-6　甲型流感病毒的分类和感染宿主

新的流感病毒发生变化的通常是外层的蛋白质。这种变化常常出现在血凝素和神经氨酸苷酶上，导致病毒的表面出现变异。这种变化称抗原性转变，它会随着时间的推移，慢慢创造出前所未见的新病毒。由于此抗原性转变一般变异所需的时间较长，人类的免疫系统容易更新自身的数据库，避免此类病毒入侵人体。但是，有时人的免疫系统却误以为变异了的流感病毒是全新病毒，识别不了它们曾是感染机体的流感病毒种类，人体就容易被变异了的流感病毒乘机入侵导致患病。此外，流感病毒会出现一种称为抗原转移的变异方式，这种方式只能在感染了的细胞中进行，具体机制是由于两种不同类型（如H1N1和H2N2）的病毒混合，导致两种病毒相互交换本身的基因，从而创造出新的病毒。此类变异一般时间急速，一旦发生变异，大多数人的免疫系统均没有此病毒的资料，因此使变异了的流感病毒能在人群中大量传染，引发流感大流行。

流感病毒对热敏感，56℃30min可被灭活，灭活的顺序为病毒颗粒的感染性、神经氨酸酶活性、红细胞凝集活性。pH＜5时或是pH＞9，病毒感染性快速会被破坏。pH5.0能使流感病毒的血凝素蛋白结构发生变化，使红细胞溶解，还对紫外线敏感，但紫外线在灭活病毒时，将会引起病毒的多重复活。因为流感病毒是一种包膜病毒，但凡能影响膜的溶剂都是敏感，包括乙醇、碘伏、氯化剂、碘酊、有机溶剂和非离子清洁剂。

1.临床诊断（流行病学资料）

（1）传染源

流感患者及隐性感染者，从潜伏期末到急性期也具有传染性，病毒在人呼吸道分泌物中一般持续排毒3～7d，儿童、免疫力低下或者危重患者排毒可超过一周。

（2）传播途径

打喷嚏和咳嗽等飞沫传播，也可经口腔、眼睛、鼻腔等处黏膜间接或直接接触传播。人群密集且通风不良的房间内可通过气溶胶的形式传播。

（3）易感人群

人群普遍易感，尤其青少年、儿童、老人、高危职业或者免疫力低下的人。可选择接种流感疫苗来预防相应的流感亚型或者流感系的感染。

2.临床症状

该流感区别于普通感冒，主要以发热、头痛、肌痛和全身不适起病，体温39～40℃，可有畏寒、寒战，多伴全身肌肉关节酸痛、乏力、食欲减退等，发热持续时间3～5d，可合并肺炎、心肌炎、中耳炎、脑膜炎等，较普通感冒症状重，临床上分为：

（1）单纯型流感

此型最常见。起病急，高热，体温可达39～40℃，可有畏寒、寒战，多伴头痛、全身肌肉关节酸痛、极度乏力、食欲减退等全身症状，常有咽喉、干咳，可有鼻塞、流涕、胸骨后不适、颜面潮红、眼结膜充血。若无并发症，呈自限性过程，多数发病3～4d后体温逐渐消退，全身症状好转，但咳嗽、体力恢复需1～2周。轻症者症状轻，如普通感冒，2～3d可恢复。

（2）肺炎型流感

患者症状表现为高热不退、咯血、发绀、气急、极度疲倦等，甚至出现呼吸衰竭，此型少见，好发于孕妇、婴幼儿、老年人、慢性心肺疾病患者及免疫功能低下的人。起病初跟单纯型流感相似，1～2d过后病情加重，痰中可分离出流感病毒。抗菌药治疗无效。此型病死亡率高，最后因呼吸及循环衰竭5～10d内死亡。

（3）中毒型流感

较少见。症状严重，出现高热、休克、弥漫性血管内凝血（DIC）等症状，病死率高。

（4）胃肠型流感

除发热症状外，以呕吐、腹泻特点显著，儿童多于成人。2～3d即可恢复。

3.实验室检测

（1）原 理

流感核酸检测使用流感病毒一对特异性引物和一条特异性荧光探针，配以反转录酶、PCR反应液、Taq酶、dNTP等成分，先将RNA反转录成cDNA，再利用PCR体外扩增法，定量检测流感病毒。基于Real-timeRT-PCR对流感病毒进行检测和鉴定的操作方法中包含了一系列寡核苷酸引物及双标记Taqman探针，可通过Real-timeRT-PCR检测方法对呼吸道样本和病毒分离培养物进行流感病毒定性鉴定。其中A型和B型流感病毒检测引物和探针为通用型检测引物和探针，可分别用于A型和B型流感病毒型别鉴定。其他引物探针为亚型特异性检测引物探针，可用于目前人群中流行的季节性流感病毒以及可以感染人的禽流感病毒亚型鉴定。推荐使用经过确认和验证过的RNA提取方法。

不同的试剂厂家有不同的操作说明，以某核酸检测试剂盒为参考：

试剂盒选用甲型流感病毒MP基因和乙型流感病毒NP基因中的高度保守系列为靶区，设计特异性引物和TapMan荧光探针，此探针能与引物扩增区域中的一段核酸模板发生特异性结合，在PCR延伸反映过程中Tap酶的外切酶活性将5’端荧光基团从探针上切下来，使其游离在反应体系中，故而脱离3’端荧光淬灭基团的屏蔽，就能接受光刺激而发出可供仪器检测的荧光。这可实现在全封闭反应体系中对甲型/乙型流感病毒核酸的自动化检测。该试剂盒中内标选用一对管家基因特异性引物结合特异性探针。此探针能与引物扩增区域中间的一段核酸模板发生特异性结合，内标选用TEXASRED通道，就可监控全封闭反应体系中的检测过程，可有效检测假阴性的发生。检测荧光通道的选择：甲型流感病毒（FAM）、乙型流感病毒（VIC）、内标（TEXASRED）。

（2）试剂仪器和操作

适用样本类型为咽拭子、鼻咽拭子等呼吸道样本等，流感核酸实时荧光检测试剂包括标本处理试剂、核酸扩增试剂和质控品。所用仪器为实时荧光PCR扩增仪。

（3）参考期间

阴性。

（4）结果判断

①阴性：FAM通道及VIC通道均无Ct值或Ct值≥40。

②阳性：FAM通道检测Ct值≤37.0时，判断该检测样品为甲型流感病毒RNA阳性。VIC通道检测Ct值≤37.0时，判断该检测样品为乙型流感病毒RNA阳性。

（5）注意事项

实验室操作应当遵守有关生物安全的规定。疑似高致病禽流感病例标本的裂解需在BSL-2级实验室操作，采取BSL-3级防护；核酸提取及加RNA模板可在BSL-2级实验室生物安全柜内操作。季节性流感病毒在BSL-2级实验室操作。本实验应严格分区操作。

（6）临床意义

疑似流感病毒感染的病人样本检测结果阳性时，可判断为感染甲型流感病毒或感染乙型流感病毒，为临床治疗提供依据。

（7）质量控制

①阴性对照：均无Ct值，内标Ct值＜40。

②阳性对照：样本FAM通道或VIC通道Ct值应＜30.0，荧光曲线应呈S形曲线，否则该次实验视为无效，查找原因或重复实验。

③若FAM或VIC通道的检测样本37.0＜Ct≤40.0的样本建议重做，若重做Ct值＜40.0，判断为阳性，否则为阴性。

④若FAM或VIC通道的检测样本测定Ct值无数值，需查看内标，若内标Ct值＜40的样本判断为阴性，内标Ct值无数值，则怀疑有假阴性的情况，应当重复实验。

核酸检测从目前来看还是首选的检测方法，在检测病毒时耗时短，结果准确，在流感防控方面是不可缺少的检测手段，但在采集标本的时候需操作规范，否则会导致漏检，所以在核酸检测的同时增加了其他方法学的检测，以提高病毒的检出率。

（二）流感病毒抗原检测

流感病毒抗原检测方法主要有ELISA、免疫荧光试验和胶体金免疫层析试验等。

1.ELISA法

（1）检测原理

采用特异的流感病毒抗体包被微孔条。患者标本（鼻咽分泌物或支气管肺泡灌洗液）中所异含的流感病毒抗原与固相载体中存在的抗体结合。HRP标记的流感病毒抗体与存在的流感病毒抗原发生特异性结合（包被抗体与检测抗体针对病毒抗原的不同表位），当加入色原体底物后，产生酶底物色原体反应，生成有色产物。加入终止液后颜色变黄，颜色强度与流感病毒抗原含量成正比。

（2）试 剂

试剂盒主要包括包被特异性抗体微孔条、标本缓冲液、洗涤液、抗流感病毒抗体酶标记物、TMB-底物溶液、阴性对照和阳性对照、终止液等。

（3）操作流程

按试剂盒使用说明书或实验室制定的SOP进行操作，主要操作过程如下：

样本稀释→样本温育→加载样本→温育反应→洗涤→加酶标二抗→温育反应→洗涤→加底物显色液→终止液→结果读取。

（4）参考区间

未感染流感病毒者，鼻咽分泌物或支气管灌洗液中流感病毒抗原为阴性。

（5）注意事项

①试剂不经复温直接使用会降低反应温度而影响反应结果；

②标本稀释应准确，稀释不准确会造成假阳性或假阴性结果；

③每次加载样本例数不宜过多，否则会增加每个反应孔间的反应时间差异；

④反应时间应严格控制，延长或缩短反应时间将影响反应结果；

⑤洗涤步骤是影响检测结果最为关键的一步，洗涤不充分会增加非特异染色，从而影响结果判断；

⑥显色反应终止后，应尽可能及时检测，以减少显色产物衰减；

⑦每次检测均应加入低值和高值质控品，以监测试剂的有效性，若能加入cut-off值质控品将对结果判断更有价值；

⑧不同厂家、不同批号试剂不能混用。更换新批号试剂时，必须用标准品与原试剂比对。

以某试剂盒简单举例说明：

（1）实验原理

由酶结合物（HRP标记的羊抗鼠IgG抗体）与存在于MDCK细胞内的病毒核蛋白抗原-核蛋白单克隆抗体复合物结合，HRP酶催化OPD，使无色底物形成橙黄色化合物。再由ELISA检测仪测定吸光度值，从而获得中和抗体滴度。

（2）试剂组成

①特异性的流感病毒抗体：鼠抗流感病毒甲型核蛋白单克隆抗体。

②HRP标记的抗体：羊抗鼠IgG。

③洗涤液：PBS（磷酸盐缓冲盐溶液）+0.05%吐温-20（配制比例：4mLPBS，pH7.2+2mL吐温-20，其中0.05%吐温-20，由10μL吐温-20溶解在20mL去离子水中）。

④封闭液：PBS+0.1%牛血清白蛋白（BSA）+0.5%吐温-20。（配制比例：867mLPBS，pH7.2+132mL，牛血清白蛋白+1mL吐温-20，其中0.1%BSA由0.1gBSA溶解在100mL去离子水中，0.5%吐温-20，由100μL吐温-20溶解在20mL去离子水中）。

⑤底物和底物溶液：常用的有辣根过氧化物酶（HRP），所用的底物为联苯二胺（OPD）。底物溶液则为pH5.0磷酸盐-枸橼酸缓冲液（0.05mol/L）［配制比例10mgOPD+20mg枸橼酸缓冲液（含0.015%过氧化氢水溶液）现配现用］。

⑥磷酸盐-枸橼酸缓冲液（pH5.0）：58.8g枸橼酸三钠，1L蒸馏水，用盐酸调节pH为5.0加0.015%双氧水（临用前加入）。

⑦终止反应液：lmol/L硫酸（28mL浓硫酸+1L蒸馏水）。

（3）手工操作步骤

① 用250μLPBS洗涤微量培养板3次，以去除残余的丙酮；

② 用封闭液1∶4000（或最佳稀释度）稀释抗体1（抗流感病毒核蛋白-NP单克隆抗体）；

③ 每孔加入1000μL稀释后的抗体1，室温作用lh；

④ 用250μL洗涤液洗涤板4次以除去抗体1；

⑤ 用封闭液1∶2000（或最佳稀释度）稀释抗体2（HRP标记的羊抗鼠IgG）；

⑥ 每孔加入100μL稀释后的抗体2，室温作用lh；

⑦ 用250μL洗涤液洗涤板6次以去除抗体2；

⑧ 每孔加入OPD底物100μL（10mgOPD+20mL枸橼酸缓冲液+1μL30%过氧化氢水溶液，即用即配）；

⑨室温放l0min左右显色，直至细胞阳性对照孔变成橙黄色，而细胞阴性对照孔尚未变色时，每孔加入1mol/L硫酸100μL终止反应；

⑩在ELISA测定以上（490nm）读出每孔OD值。

（4）参考区间

阴性。

（5）结果判读

在特殊情况下可用目测法判定结果，即加入底物后，肉眼下出现橙黄色反应的为阳性，无色的为阴性。待检系列稀释血清中无色孔的最高稀释度即为血清的中和抗体滴度。

（6）注意事项

① 因为每个试剂盒的试剂稍有不同，则可能需要优化抗体的量，防止非特异性抗体结合，不能过多使用一抗或者二抗。

② 有些试剂盒包含封闭液，封闭液是让不相关的蛋白占据微孔板中潜在的结合位点，这就降低了非特异结合。

③每次实验必须进行质量控制，设定阴性和阳性对照。待检血清需要重复测定时，应分装后冻存，以免反复冻融。

④待检人血清需56℃灭活30min，动物血清需RDE处理。

⑤ 每管病毒只能使用一次，若重复使用，或血清阳性对照结果过高或过低，以及细胞阳性对照0D值过低，须对病毒进行重新滴定。

⑥ 牛血清中有中和病毒感染力的作用，试验过程中切勿将细胞培养液与病毒稀释液混淆使用。

⑦病毒与抗血清混合，常规采用37℃作用lh，该试验采用37℃作用2h，但针对不同耐热性的病毒，孵育温度和时间应有所增减。

⑧大量测定时，为稳定培养液的pH，可用HEPES增加溶液的缓冲能力，减少pH变化对细胞的不利影响。

2.免疫荧光试验

（1）原 理

荧光标记（如FTC）的某流感病毒特异性单克隆鼠抗体与鼻咽分泌物或肺泡灌洗液的细胞涂片中（或经加入上述标本的单层细胞孵育后）相应的病毒抗原结合后，形成抗原抗体复合物，荧光显微镜下细胞内显示特异性荧光。而未发生抗原抗体特异性反应的细胞，被伊文斯蓝染成红色。

（2）试 剂

试剂盒组成包括：荧光标记的某流感病毒特异性单克隆鼠抗体、缓冲复染剂、洗涤浓缩液、封闭液等。

（3）操 作

按试剂盒使用说明书或实验室制定的SOP进行操作，主要操作过程如下：细胞涂片制备加荧光标记的流感病毒单克隆抗体→温育反应→洗涤→封片→观察结果。

注：细胞涂片的制备简述如下

吸取1～2mL鼻咽分泌物或支气管灌洗液置于15mL离心管中，加入4～8mLPBS，用旋涡混合器振荡3～5min，800～1000r/min离心10min，弃上清，如有黏液一并弃去。沉淀物洗涤2次后，加入适量PBS悬浮细胞，吸取25μL该细胞悬液点于多孔玻片上，室温下空气干燥后用4℃丙酮固定10min备用。

（4）参考区间

未感染流感病毒者，鼻咽分泌物或支气管灌洗液中流感病毒抗原为阴性。

（5）结果判定

荧光显微镜下读片，如果一孔涂片中大约含有200个细胞，则认为此片是可以评价的。

①阴性：荧光显微镜下观察反应底物片，未发生抗原抗体特异性反应的细胞，被伊文斯蓝染成红色。

②完整细胞内显示明亮的苹果绿荧光为阳性细胞，当放大倍数为200倍时，在整个涂片中找到≥2个阳性细胞，判为标本阳性反应。

③不同亚型的流感病毒感染的细胞在染色上略有差异。

以某试剂盒简单举例说明：

（1）实验原理

荧光标记的某流感特异性单克隆抗体与细胞涂片中的相应的病毒抗原相结合，在荧光显微镜下细胞内显示荧特异性荧光。

（2）试剂成分

pH7.2PBS，特富龙涂层的12孔显微载玻片，100%冰丙酮，流感相应亚型的特异性抗体，免抗鼠荧光素结合物（二抗），染液0.1%埃文斯蓝，细胞维持液成分500mLD-MEM液中加入：青霉素、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素）；牛血清白蛋白组分V12.5mL（终浓度：0.2%）；HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mmol/L）。

（3）手工操作步骤

标本前处理：

将收集的呼吸道分泌物中加入维持培养液至总体积为4mL；使用吸管吹打悬浮液数次；2OOOr/min离心5min；保留上清液做培养；用10mLpH7.2PBS清洗细胞沉淀，弃上清；用0.5mLpH7.2PBS重新悬起沉淀。

实验步骤：

①在特富龙涂层的12孔显微载玻片的每个孔上加入10μL细胞悬浮液；

②用载玻片干燥器干燥载玻片或室温自然干燥；

③用100%冰丙酮室温固定载玻片l0min；

④室温晾干载玻片；

⑤每孔加10μL流感相应亚型的特异性抗体（1:1000）；

⑥玻片在湿盒中37℃放置45min；

⑦pH7.2PBS洗涤1min；

⑧室温晾干载玻片；

⑨每孔加入1OμL1:20兔抗鼠荧光素结合物（二抗），及0.1%埃文斯蓝做负染；

⑩玻片在湿盒中37℃放置45min；

⑪pH7.2PBS洗涤1min；

⑫室温晾干载玻片；

⑬加上盖玻片，加上甘油；

⑭在400X荧光显微镜下检查。

（4）参考区间

阴性。

（5）结果判读

阳性讯号：细胞质内显示苹果绿色荧光，阴性讯号：细胞质为深红色部分，观察到三个以上荧光阳性即可判为阳性。

（6）注意事项

①荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，会使荧光减弱。

②染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10min到数小时，一般30min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0～2℃的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37℃30min效果好得多。

③为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。

④已知抗原标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。

⑤所滴加的液体应始终保持在已知标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。

⑥一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。

3.胶体金免疫层析试验

（1）原 理

在试纸条预先固定抗某型流感病毒核心蛋白单克隆抗体，以及胶体金标记有另一株抗同型流感病毒核心抗原单克隆抗体，建立的双抗体夹心免疫学检测方法。在测试过程中，如果样品中有该型流感病毒，则发生特异性抗原抗体反应，出现阳性结果；如果没有该型流感病毒，则不发生反应，出现阴性结果。

（2）试 剂

试剂盒组成包括：包被特异性流感病毒抗体的检测板、标本抽提液、灭菌棉棒、滴头、抽提用管子等。

（3）操 作

按试剂盒说明书或实验室制定的SOP进行操作，主要操作过程如下：

样本处理→加载样本→结果判定。

（4）结果判定

①阳性反应：在检测区（T）和对照区（C）各出现一条红色色带。

②阴性：只在对照区（C）位置有一条红色带出现。

③无色带出现或仅在检测线位置出现一条红色带，应检查产品的失效日期，可使用有效期内的产品，按照说明书的要求重新检测一次。

（5）参考区间

未感染流感病毒者，鼻咽分泌物或支气管灌洗液中流感病毒抗原为阴性。

（6）注意事项

①请使用本产品中提供的棉棒进行采样。收集鼻腔擦拭液时，将棉棒插入鼻孔中分泌物最多的部位，轻轻摇动棉棒，同时向鼻腔内部推进，直至鼻甲骨部位（鼻腔内不足一英寸的部位），在鼻腔内壁上轻摇几下棉棒，取出。将擦拭后的咽拭子在纯水中充分搅拌，使鼻腔分泌物溶于水中。取出300uL溶解有鼻腔分泌物的样品加入吸稀释液冻干品中，充分溶解后作为待检测样品。

②本产品仅用于体外诊断，开封后请立即使用。(www.xing528.com)

③不要用手直接接触检测板的样品滴下部和判定部。

④请不要在样品滴下后15min内判定结果，因为胶体金标记抗体的开展还不完全，可能影响检测结果。

⑤请在样品滴下后15min后迅速判定结果，时间过长因检测板干燥可能影响结果。

⑥当判定部质控处没有条带出现时，可能因为操作错误或检测板质量问题，需用其他检测板重试。

⑦检测使用后的废弃物品，请按规定处理。

（三）流感病毒抗体检测

流感病毒抗体的检测方法临床常用的主要有血凝抑制试验和中和试验等。

1.血凝抑制试验

（1）原 理

流感病毒颗粒表面的HA蛋白，具有识别并吸附于红细胞表面受体的结构，HA试验由此得名。HA蛋白的抗体与受体的特异性结合能够干扰HA蛋白与红细胞受体的结合从而出现抑制现象。

（2）试 剂

阿氏液，10%和1%鸡红细胞液、流感病毒等。

（3）操 作

按实验室制定的SP进行操作，主要操作过程如下：样本稀释→加载鸡红细胞悬液→振荡混匀→温育反应→观察结果。

（4）参考区间

在未感染流感病毒者血清中，流感病毒抗体为阴性。

（5）结果判定

阳性对照红细胞将呈现纽扣状沉于孔底（表3-7）。

表3-7　血凝试验结果判读标准

能使红细胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位（HAU）。注意对照空应呈现完全不凝集（-），否则此次检验无效。试验成立的条件：样本倍比稀释中，只有阴性对照孔血清滴度不大于2log2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。以完全抑制4UHA抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。HI价小于或等于3log2判定HI试验阴性，HI价大于或等于4log2为阳性反应。

（6）注意事项

①合理选择抗原和对照阳性血清：针对Re-4和Re-5株疫苗免疫采用相应抗原和对照阳性血清。同一亚型的禽流感病毒制成的抗原，如果毒株来源不同，则可能会存在抗原性差异，从而使检测同一血清的结果有差别。一般来讲，疫苗种毒株如果与抗原所用毒株相同时，则所测得的HI效价较高。

②合理使用和保存抗原：反应试剂要按规定保存和使用，冻干的试剂应按照说明书中规定的体积重新溶解并保存。要避免杂菌污染，因为污染所造成的非流感起源的凝集素也可与所有抗血清发生非特异反应。为避免反复冻融和细菌污染，可以无菌操作将试剂分装成小包装。

③反应温度：不能太高，若在37℃（如温箱）下进行，会影响检测结果。

④掌握好温育时间：本操作中HA和HI试验中加入红细胞后的作用时间均为40分钟，主要是参照世界动物卫生组织（OIE）标准，在一些病毒株中可见红细胞从病毒中解脱，如果有这种情况的发生，要提前判定（25～30min）或4℃下孵育。一般来讲，以红细胞对照孔出现完全沉淀时迅速判定结果。

⑤标准抗原稀释液浓度必须为4个HA单位，必须每天制备并在试验前滴定（表3-8）。

表3-8　抗原标定方法

⑥红细胞悬液要始终符合标准，使用时随时振荡。

⑦每次试验时均应设2个阳性血清对照、1个阴性对照。阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。

阳性血清的标定：具体操作可在购进一批标准阳性血清以后，取几瓶血清，溶解到一起，分成小包装，-70℃（无条件者可用-20℃）保存备用，每次取出时取一小管。标定时取冻存血清1支，由几个操作人或分几次（红细胞等最好是分别配置）检测阳性血清效价，取平均值作为最终的标准阳性血清效价。

⑧注意非特异性凝集素的消除。禽类血清中，尤其水禽血清，往往含有非特异性血凝抑制因子，在做禽流感血凝抑制试验时会出现2～3孔有凝集现象。因此，在利用血凝抑制试验进行人血清抗体检测之前，有必要对血清中非特异性因子进行排除。患者血清采取56℃水浴30min，加入等体积的1%鸡红细胞，混匀，室温静置30min，1500～1800rpm离心5～10min，取上清液检测，结果判定时增加一个滴度。

以某试剂盒为例：

（1）原 理

流感病毒表面的血凝素HA能够引起红细胞的凝集，实验用于检测红细胞凝集活性，当血清中特异性抗体与病毒血凝素结合后，则可以抑制红细胞凝集的出现。

（2）试剂成分与配制

①缓冲液及其他试剂配制和试剂成分

红细胞悬液（鸡、火鸡、豚鼠、或人“O”型红细胞，由于“O”相毒株不能凝集鸡红细胞，所以在对该种病毒进行鉴定时应使用豚鼠红细胞或人“O”型红细胞），生理盐水。

磷酸缓冲液（PBS）：0.01mol/L，pH7.2：25×PBS母液：2.74gNa2HPO4，0.79gNaH2PO4加去离子水至100mL。

工作液配制：25倍PBS缓冲液完全溶解后，取40mL25倍PBS液，加入8.5gNaCl，加去离子水至1000mL。用lmol/LNaOH或lmol/LHC1调整pH至7.2。121℃高压灭菌15min，消毒后至4℃保存。

生理盐水0.85%NaCl：20X母液50mL加入去离子水950mL。121℃高压灭菌15min，消毒后至4℃保存。

阿氏液配制：25g葡萄糖+8.5g枸橼酸钠+4.5gNaCl+0.55g枸橼酸，加去离子水1000mL，用lmol/LNaOH或lmol/LHCl调整pH至6.1，用0.22μm的细菌滤器过滤，或121℃高压灭菌30min，消毒后至4℃保存。

红细胞悬液配制：取阿氏液中的红细胞，1200r/min离心5min，弃上清。加入至少10倍沉淀物的PBS液体洗涤，充分混匀，1200r/min离心5min，弃上清。PBS液体按以上方法洗涤三次。最后一次洗涤后，1200r/min离心10min将红细胞加入合适的PBS中，稀释至合适的浓度，通常为1mL红细胞加入99mLPBS中（1%）。火鸡、鸡的红细胞，实验终浓度一般为0.5%。

②已知标准抗原

如常用的以下几种抗原：

A（H1N1）亚型代表毒株标准抗原；

A（H3N2）亚型代表毒株标准抗原；

B型Yamagata系代表毒株标准抗原；

B型Victoria系代表毒株标准抗原。

（3）手工操作步骤

①制备4个红细胞凝集单位抗原

②根据所用红细胞选用适当的微量板，须设立血清对照板。

③除A行外，每孔加入25mLPBS缓冲液。

④按以下顺序，在A行各孔加入处理过的血清50μl。

A1：待检血清标本1，急性期血清；

A2：待检血清标本1，恢复期血清；

A3：待检血清标本2，急性期血清；

A4：待检血清标本2，恢复期血清；

A5：待检血清标本3，急性期血清；

A6：待检血清标本3，恢复期血清；

A7：待检血清标本4，急性期血清；

A8：待检血清标本4，恢复期血清；

A9：A（H1N1）亚型标准抗血清；

A10：A（H3N2）亚型标准抗血清；

A11：B型Yamagata系标准抗血清；

A12：B型Victoria系标准抗血清。

⑤用多道加样器从A行各孔分别吸取25μL血清，由A行至H行进行2倍稀释血清，弃去H行最后25μL。

⑥红细胞凝集抑制试验板：每孔加入25μL新配制的4个凝集单位的抗原。

⑦血清对照板每孔加入25μLPBS。

⑧轻轻弹击微量板，使抗原与抗体充分混合。

⑨室温孵育15min。

⑩每孔加入50μL红细胞悬液，混匀。

⑪室温孵育30～60min。

⑫观察红细胞凝集抑制试验结果，对照板应不出现凝集。

⑬制备4个红细胞凝集凝抗原时，首先计算出红细胞凝集抑制试验所需的病毒抗原的总量。如每份血清做8孔稀释，每孔用抗原25μL抗原，那么测定一份血清须0.2mL抗原。根据标准血清的份数计算出实验所需病毒抗原量，然后配制抗原。

⑭RDE受体破坏酶处理标准：1份血清加入4份RDE（受体破坏酶）混合；37℃水浴过夜；56℃水浴加热30min，灭活RDE的活性。

⑮判断处理后血清中有无残留非特异性凝集素应该选用适当的微量板，从Bl至H6中加入25μLPBS；Al到A5各加50μL处理后的血清，A6加50μLPBS；用多道加样器从A1行开始，各孔取25μL血清，由A行至H行进行2倍稀释血清；H行各孔稀释混匀后其取25μL；每孔补加25μLPBS；每孔加入5OμL红细胞悬液，混匀；置室温（22～25℃）30～60min，观察有无凝集，如出现凝集则表示血清中有残余的非特异性凝集素。该血清必须用红细胞吸附去除非特异性凝集素后才能使用。

⑯红细胞吸附去除非特异性凝集素,先用1体积的红细胞可以去除20倍体积的RDE处理过的血清；红细胞与血清混匀后，置4℃，1h；1200r/min离心l0min；小心吸取上清液；重复操作直至血清中的非特异性凝集素被去除。

（4）参考区间

阴性不凝集。

（5）注意事项

①病毒必须灭活，红细胞凝集抑制试验必须用4个凝集单位/25μL的抗原，抗原必须新鲜配制。

②孵育时间准确，有些病毒引起的凝集现象因病毒游离消失很快，可以将反应板放置4℃，或缩短孵育时间来解决此类问题。

③红细胞悬液的配制必须标准化。

④正确存放试剂，避免反复冻融及污染。

⑤冻干的试剂应按照说明溶解，保存。

⑥标准血清对照，阴性对照血清，以防其他非特异性抗体的影响。

2.中和试验

（1）原 理

中和试验是以检测病毒的感染力为基础，以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，来判定免疫血清中和病毒的能力。

（2）试 剂

已知滴度的流感病毒、阳性对照血清、阴性对照血清、狗肾细胞MDCK和细胞培养试剂等。

（3）操 作

按实验室制定的SOP进行操作，主要操作过程如下：病毒制备→病毒滴度检测→血清稀释→加载血清和病毒到MDCK细胞→温育反应→观察结果。

（4）参考区间

在未感染流感病毒者血清中，流感病毒中和抗体为阴性。

（5）结果判定

当阳性、阴性、正常细胞等对照相，血清毒性对照全部成立时，才能进行判定，被检血清孔出现100%细胞病变效应判为阴性，50%以上细胞出现保护者为阳性；

固定病毒稀释血清中和试验的结果计算，是计算出能保护50%细胞孔不产生细胞病变的血清稀释度，该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。

（6）注意事项

①待检人血清需56℃30min灭活，动物血清需受体破坏酶（RDE）处理。

②待检血清需要重复检测时，应分装后冻存，以免反复冻融。

③每管病毒只使用一次，若重复使用，或血清阳性对照结果过高或过低，以及细胞阳性对照OD值过低，须对病毒进行重新滴定。

④细胞应处于对数生长期，严禁细胞过度生长或老化（代数过高）。因此，必须在10代前进行细胞冻存，保存于液氮中备用。

⑤牛血清有中和病毒感染力的作用。试验过程中切勿将细胞培养液与病毒稀释液混淆使用。

⑥病毒与抗血清混合，常规采用37℃作用1h，该试验采用37℃作用2h，但针对不同耐热的病毒，温育温度和时间应有所增减。

以某试剂盒提供的检测为例：

（1）原 理

以测定病毒的感染力为基础，血清中的病毒特异性中和抗体与病毒表面蛋白结合，从而使病毒失去吸附和感染宿主细胞的能力。结果的判定将依据定量病毒倍比稀释免疫血清中和后的感染力。

（2）试剂成分

①抗体1（鼠抗流感病毒甲型核蛋白单克隆抗体）；抗体2（HRP标记的羊抗鼠IgG）。

②封闭液，洗涤液底物和底物溶液，PBS，终止反应液。

③MDCK细胞和细胞培养液试剂。

MDCK细胞：低代数的MDCK细胞（小于25代）。

MDCK细胞培养液：D-MEM+5%胎牛血清+抗生素。

500mL D-MEM培养液

5.5mL 青霉素、链霉素母液（10000U/mL青霉素；10000μg/mL硫酸链霉素）

25.5mL 胎牛血清，40nm过滤

EDTA-胰酶

④病毒稀释液：DMEM+1%牛血清白蛋白+抗生素，即配即用。

429mL DMEM

66mL 7.5%牛血清白蛋白（BSA）

5mL 稀释倍数抗生素

⑤TPCK-胰酶（使用浓度为2mg/mL）。

⑥固定液：80%的丙酮，即配即用，4℃保存。

400mL丙酮

100mLPBS，pH7.2

⑦平底96微孔培养板。

（3）手工操作步骤

在进行中和实验之前，需先进行病毒滴度的测定（组织细胞半数感染量-TCID滴定）。

①流感病毒的制备

利用鸡胚尿囊腔接种法制备流感病毒，收获尿囊液，通过红细胞凝集试验测定病毒的存在，分装后-70℃冻存。

②病毒的稀释

取1管冻存病毒尿囊液，1:100稀释。

第一排孔加入146μL1:100稀释过的病毒液，然后做系列半对数稀释，使之成为10-2、10-2.5、10-3、10-3.5…10-7。每孔含有l00μL病毒液，每个稀释度重复4孔。

人流感病毒一般在胰酶存在的条件下才能感染MDCK细胞，因此病毒稀释液中需加入终浓度为2μg/mLTPCK-胰酶。某些毒性很高的禽流感病毒在无胰酶存在条件下即可感染MDCK细胞，因此在测定新病毒滴度时，最好配制含有和不含有胰酶的两种稀释液，以获得最佳结果。

③MDCK细胞的准备

使用前2d将MDCK细胞1:10传代，使之70%～90%成片，处于对数生长期的细胞对病毒具有最大的敏感性，细胞过度生长以及代数太高（大于25代）将使细胞对病毒的敏感性降低。

A.弃去细胞培养液，用5mLEDTA-胰酶洗细胞一次，然后弃去。

B.加4～5mLEDTA-胰酶覆盖细胞（162cm2的细胞培养瓶），37℃培养箱中消化l0～20min。

C.待细胞开始脱落时，加入5～10mLMDCK细胞培养液，吹打分散细胞，并将细胞转入离心管，2000r/min离心5min，用PBS洗涤2次，以除去牛血清。

D.将细胞悬浮于1mL病毒稀释液中，用吸管充分吹打分散细胞，加病毒稀释液至10mL，用细胞计数板计数细胞数量。

E.用病毒稀释液将细胞稀释成1.5×105细胞/mL。

F.加100μL细胞（1.5×104细胞/孔）于已稀释好病毒的微量细胞液培养板中。

G.在35℃，5%CO2孵箱中培养18h～20h。

④测定组织细胞半数感染剂量（TCID50）

A.弃去微量培养板中的细胞液，250μLPBS洗细胞一次；

B.弃去PBS（不要让细胞干燥），每孔加入100μL固定液；

C.覆盖微量培养板，于室温固定细胞l0min；

D.弃去固定液，让微量培养板室温干燥；

E.用ELISA检测细胞感染（参见ELISA部分）；

F.利用ELISA检测仪，于490nm波长测定每孔吸光度（OD）值，计算细胞对照孔的平均OD值；若含有不同稀释度病毒孔平均OD值是细胞阴性对照孔平均OD值2倍以上，则判断为病毒生长阳性；

G.在进行中和实验前，稀释病毒液，使之50μL含有100 TCID50病毒。

⑤待检血清的准备和稀释

A.检测一种病毒的中和抗体需要10微升血清，每份血清须进行至少一次重复测定，每块板可检测11份样品；

B.人血清需56℃加热灭活30min；

C.每孔中加入50μL病毒稀释液；

D.第一排中（A1～A11）在加入40μL病毒稀释液，使之成为90μL/每孔；

E.加入10μL待检血清于第一排Al～All；

F.将待检血清做系列倍比稀释（A～H）使之成为1:10、1:20、1:40……1:280。

⑥病毒的准备

A.稀释病毒至100 TCID50/50mL。根据病毒特性选择是否在稀释液中加入TPCK胰酶（大约5mL/板）。

B.除细胞阴性对照外，每孔加入50μL病毒工作液。

C.加入50μL病毒稀释液于细胞阴性对照孔。

D.选择1列孔做病毒工作液滴度核实。每孔加入200 TCID50/100mL，做系列倍比稀释，使之成为100 TCID50、50、25、12、6、……0.7。然后每孔加入50μL病毒稀释液使体积成为100μL/孔。摇匀病毒-血清混合物，放入37℃温箱作用2h。

E.MDCK细胞的准备

加100mL细胞液（1.5×104细胞/孔）于含有病毒-血清混合物以及倍比稀释病毒工作液的微量板中，35℃温箱孵育18～22h。

当测定大量样品时，每叠培养板一般不超过4～5块，各叠板之间要保持一定距离，以确保混合物受热均匀，从而达到良好的中和效果。

F.细胞固定：弃去微量培养板中的细胞液；250mLPBS洗细胞一次；弃去PBS（不要让细胞干燥），加入l00μL/孔固定液；覆盖微量培养板，于室温固定细胞l0min；弃去固定液，让微量培养板室温干燥。后续实验参照上述ELISA实验进行。

（4）参考区间

阴性。

（5）结果判读

X=（细胞阳性对照平均OD值一细胞阴性对照平均OD值）/Z+细胞阴性对照平均OD值……（C.2）X为细胞半数感染域值，每孔OD值低于X值时，判定为中和试验反应阳性，中和反应阳性的血清最高稀释度即为血清的中和抗体滴度。

（6）注意事项

①阴性细胞对照孔0D值一般小于0.2，阳性细胞对照孔的0D值一般在1左右；

②每次测定过程中，阳性血清对照的中和抗体滴度应该在2倍之内波动。

③大量测定时，为稳定培养液的pH，可用HEPES增加溶液的缓冲能力，减少pH变化对细胞的不利影响。