常用层析技术简介

1.吸附层析

吸附层析是应用最早的层析技术，其原理是利用固定相（吸附剂）对物质分子的吸附能力差异来实现对混合物的分离。任何两个相之间都可以形成一个界面，其中一个相中的物质在两相界面上的密集现象称为吸附。吸附剂一般是固体或者液体，在层析中通常应用的是固体吸附剂。吸附剂主要是通过范德华力将物质聚集到自己的表面上，这样的过程就是吸附；然而，这种作用是可逆的，在一定条件下，被吸附的物质可以离开吸附剂表面，这样的过程就是解吸。

选择好适当的吸附剂是取得良好分离效果的前提和关键。吸附能力的强弱与吸附剂以及被吸附物质的结构和性质密切相关，同时吸附条件、吸附剂的处理方法等也会对吸附分离效果产生影响。一般来说，极性强的物质容易被极性强的吸附剂吸附，非极性物质容易被非极性吸附剂吸附，溶液中溶解度越大的物质越难被吸附。

吸附剂通常由一些化学性质不活泼的多孔材料制成，比表面积很大。常用的吸附剂有硅胶、羟基磷灰石、活性炭、磷酸钙、碳酸盐、氧化铝、硅藻土、泡沸石、陶土、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖、琼脂糖、菊糖、纤维素等。此外，还可在吸附剂上连接亲和基团而制成亲和吸附剂。选择吸附剂时，要考虑以下几点：吸附剂应当具有适当吸附力，颗粒均匀，表面积大；吸附选择性好，对不同组分的吸附力有一定的差异，有足够的分辨力；稳定性好，不与被吸附物或洗脱剂发生化学反应，不溶解于层析过程中使用的任何溶剂和溶液；吸附剂与被吸附物的吸附作用是可逆的，在一定条件下可以通过洗脱而解吸。吸附剂在使用前，一般要经过一些活化处理来去除杂质，提高吸附力，增强分离效果。例如，氧化铝和活性炭等吸附剂在使用前要经过加热处理以除去吸附在其中的水分。有时，吸附剂还需经过酸处理以除去吸附在其中的金属离子。

柱层析是吸附层析常用的形式。将经过活化处理后的吸附剂装到层析柱中，待吸附柱装填好后，将适量的待分离样品上柱吸附。当样品全部进入吸附柱后，加入洗脱剂进行洗脱。洗脱的目的就是将需要得到的被吸附组分从吸附剂上解吸下来，因此要根据吸附剂和各组分的性质来合理选择洗脱剂。非极性物质用非极性溶剂洗脱，极性物质用极性大的溶剂洗脱效果好。常用洗脱剂按极性从高到低排列如下：水、甲醇、乙醇、正丙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、乙醚、二氯甲烷、苯、甲苯、三氯己烷、四氯化碳、环己烷、石油醚等。一般色素等物质被极性较弱的硅胶吸附后，可用有机溶剂洗脱。蛋白质被极性强的羟基磷灰石吸附后，要用含有盐梯度的缓冲液来洗脱。洗脱剂的选择要考虑以下几点：洗脱剂对各组分的溶解度大，黏度小，流动性好，容易与被洗脱的组分分离；纯度高，以免杂质影响分离效果；稳定性好，不与吸附剂起化学反应，不能溶解吸附剂。为了能得到较好的分离效果，常用两种或数种不同强度的溶剂按一定比例混合，得到合适洗脱能力的溶剂系统，以获得最佳分离效果。

洗脱过程中，层析柱内的被分离物质不断地与吸附剂发生解吸、吸附、再解吸、再吸附作用。被吸附在吸附剂上的组分在洗脱剂的作用下解吸而随之向下移动，遇到新的吸附剂被重新吸附，然后又被后面的洗脱液解吸而向下流动。如此反复进行，直到流出层析柱。由于吸附剂对不同组分的吸附力大小差异和洗脱剂对不同组分的解吸能力差异，因而不同组分在层析柱中向下移动的速度不同。吸附力强而解吸力弱的组分向下移动的速度最慢，吸附力弱而解吸力强的组分向下移动的速度最快。这样，各组分就按照一定的顺序被洗脱下来，从而达到分离的效果。

洗脱完成后，对用过的吸附剂进行再生处理，恢复其吸附性能。不同吸附剂的再生方法不同，主要有加热再生法、化学再生法和生物再生法。加热再生法是指在高温条件下，被吸附物的动能增大，因而容易从吸附剂活性中心脱离，同时，被吸附有机物在高温下会发生氧化降解，可能以气态分子的形式逸出或者断裂成短链而减小了吸附力。化学再生法是指被吸附物通过化学反应转化为易溶于水的物质而被解吸。生物再生法是指利用微生物的作用，将被活性炭等吸附剂吸附的有机物降解，从而使它们从吸附剂上解吸下来。

2.离子交换层析

离子交换层析是目前最常用的层析方法之一，广泛地应用于生物大分子的分离纯化，包括蛋白质、氨基酸、多糖等。其固定相是离子交换剂，原理是利用离子交换剂上的活性基团对各种离子或离子化合物的亲和力不同而达到分离的目的。

离子交换剂由基质（高分子物质）、活性基团和反离子三部分组成，它是通过在不溶性的惰性高分子物质上引入若干活性基团而制成的。例如

离子交换剂具有高度的不溶性，在各种溶剂中呈不溶解状态，但能释放反离子，反离子能够在交换剂中自由扩散，同时与溶液中其他离子或离子化合物进行可逆性结合，并且结合后本身的理化性质不变。离子交换剂的基质有多种，包括疏水性的树脂和亲水性的纤维素、葡聚糖、琼脂糖等。树脂是人工合成的难溶于一般溶剂的高分子聚合物，呈海绵状结构。离子交换树脂含有大量的活性基团，交换容量高，流动性好，机械强度大，主要用于分离氨基酸等小分子物质和某些不易变性的蛋白质。纤维素等亲水性基质是天然或人工合成的，它们具有松散的亲水性网络，具有较大的表面积，对生物大分子有较好的通透性，主要用于分离蛋白质、多糖等大分子物质。

根据引入基质上的活性基团的不同，离子交换剂又可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。活性基团是磺酸基（—SO3H）、磷酸基（—PO3H2）、羧基（—COOH）等酸性基团的离子交换剂称为阳离子交换剂，它们在溶液中可解离出氢离子（H+），在一定条件下，可与其他阳离子（A+）进行交换。活性基团是季胺［—N+（CH3）3］、叔胺［—NN+（CH3）2H］、仲胺［—N+（CH3）H2］等碱性基团的离子交换剂称为阴离子交换剂，它们在水中可解离出氢氧根（OH-），可与其他阴离子交换（B-）。其交换原理可用如下反应式表示：

R—SO3H+A+⇔R—SO3A+H+

R—N+（CH3）3OH-+B-⇔R—N+（CH3）3B-+OH-

离子交换剂对不同离子的亲和力大小不一样，通常亲和力大小随离子价数和原子序数的增加而增大，随离子表面水化膜半径的增加而降低。强酸型阳离子交换剂的活性基团为强酸性基团，如磺酸基［—SO3H］，容易在溶液中解离出H+，呈强酸性。强酸型阳离子交换剂对阳离子的亲和顺序如下：Fe3+＞Al3+＞Pb2+＞Ca2+＞Mg2+＞K+＞Na+＞H+。弱酸型阳离子交换剂的活性基团为弱酸性基团，如羧基（—COOH），能在水中解离出H+，呈酸性。弱酸型阳离子交换剂对H+的亲和力特别大，容易转变为氢型交换剂。强碱型阴离子交换剂的活性基团为强碱性基团，如季胺［—N+（CH3）3］，容易在水中解离出OH-，呈强碱性。强碱型阴离子交换剂对阴离子的亲和顺序如下：。弱碱型阴离子交换剂的活性基团为弱碱性基团，如叔胺［—N+（CH3）2H］，能在水中解离出OH-，呈弱碱性。弱碱型阴离子交换剂对阴离子的亲和顺序如下：＞柠檬酸根＞酒石酸根＞＞CH3COO-＞Br-＞CI-。

离子交换剂的选择一般按照以下原则。

（1）阴阳离子交换剂的选择。取决于被分离物质所带的电荷。若被分离物质带正电荷，应用阳离子交换剂；若带负电荷，则应用阴离子交换剂；若为两性物质，则应根据其在稳定的pH值范围内所带电荷来选择。例如：某蛋白质的pI=5.0，若其pH值在5～8稳定，则应用阴离子交换剂；若其在pH值＜5稳定，则应用阳离子交换剂。

（2）强弱型离子交换剂的选择。强型离子交换剂适用的pH值范围广，常用来制备去离子水和分离在极端pH值环境中解离且较稳定的物质；弱型离子交换剂的适用范围较窄，在中性溶液中的交换容量也较高，用其分离生物大分子物质时，不易引起失活，因此习惯采用弱型离子交换剂来分离生物样品。

（3）不同离子型交换剂的选择。离子交换剂处于电中性时常带有一定的反离子，为了提高交换容量，一般应选择与交换剂结合力较小的反离子。强酸型阳离子交换剂多选择H+型，弱酸型阳离子交换剂多选择Na+型，强碱型阴离子交换剂多选择OH-型，弱碱型阴离子交换剂多选择Cl-型。

（4）不同基质离子交换剂的选择。离子交换剂的基质是疏水的还是亲水的，对被分离物质的稳定性和分离效果均有影响。一般地，分离生物大分子物质时，选择亲水性基质的交换剂比较合适，因为它们对被分离物质的吸附和洗脱都比较温和，不会导致生物大分子物质失活。

蛋白质、多糖等生物大分子进行离子交换层析，通常采用柱层析的形式。将经过适当预处理的离子交换剂装填到层析柱中，经过转型成为所需的离子型交换剂，接着用缓冲液平衡。然后，将待分离样品加入到层析柱中，即上柱。上柱样品的pH值、离子浓度等条件要控制好，以保证样品中不同组分能够很好地分离。上柱完毕后，采用适当的洗脱液，将原来紧密吸附的各组分按一定顺序从柱上洗脱下来，从而达到分离的效果。通常采用改变洗脱液离子强度或者pH值的方法来降低各组分与离子交换剂的亲和力，从而将它们从离子交换剂上洗脱下来。实际上，待分离样品中有各种各样的组分，在同一洗脱条件下，可能有若干组分都处于相同的状态，因此，采用同一种洗脱条件很难将多种组分很好地分离开来。通常采用不同的洗脱条件进行洗脱，常用的洗脱方式有梯度洗脱和阶段洗脱。梯度洗脱时，洗脱液的离子强度或者pH值是逐步、连续地改变的，从而将各组分先后逐个地从离子交换剂上洗脱下来。阶段洗脱是用不同条件的洗脱液相继进行洗脱，比较适用于被分离各组分与离子交换剂的亲和力相差较大的情况。洗脱完成后，要对离子交换剂进行再生处理，以便重复使用。一般情况下，对其进行转型即可。但多次使用后，离子交换剂会含有较多的杂质，一般要先经过酸、碱处理，再进行转型。

3.凝胶层析

凝胶层析是以多孔凝胶为固定相，按照相对分子质量的不同而使物质分离的一种层析技术，又称为凝胶过滤、分子筛层析、凝胶排阻层析、凝胶渗透层析等。

自20世纪50年代末期以来，作为一种快速而简便的分离技术，凝胶层析广泛应用于生物、医学等领域的实验研究和工业生产中。凝胶层析所需设备简单、操作简便，分离条件温和，凝胶材料本身不带电荷，并具有亲水性，不会与被分离物质互相作用，对被分离物质的活性没有不良影响，适用于分离不稳定的化合物。分离效果好，重现性强，样品回收率高，接近100%。每个样品洗脱完毕，柱已再生，可反复使用。样品的用量范围广，从小量分析到大量制备均适合。适用于各种生物化学物质，如蛋白质、多糖、多肽、核酸等的分离、脱盐、浓缩及分析测定等。

凝胶是一类具有三维网状结构的高分子聚合物，内部多孔，每个颗粒的细微结构及孔穴的直径均匀，犹如一个筛子。将凝胶颗粒装入柱中，当含有分子大小不一的样品混合液通过凝胶柱时，各物质在层析柱内同时进行两种运动：一方面随着洗脱溶液的流动而进行的垂直向下的运动，另一方面是无定向的分子扩散运动，各物质的扩散程度取决于其分子大小和凝胶内孔穴的大小。大分子物质的分子直径大于凝胶内部孔穴的孔径，不能扩散到孔穴内部，完全被排阻于凝胶颗粒外部，它们只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着洗脱溶剂而向下流动，因此经历的流程较短，移动速率快，先流出层析柱；小分子物质的分子直径小于凝胶内部孔穴的孔径，可自由地扩散到凝胶颗粒孔穴内，然后再扩散出来，这样不断地进出于一个个颗粒的孔穴内外，经历的流程长，向下移动的速率慢，后流出层析柱；而中等大小的分子，它们也能在凝胶颗粒内外分布，部分扩散进入凝胶内部，扩散的程度取决于它们的分子大小，因此它们在大分子物质与小分子物质之间流出层析柱，分子越大的物质越先流出，分子越小的物质越后流出。这样，经过凝胶层析柱后，样品混合液中各物质就按分子大小不同而被分离开来。在凝胶层析中，分子大小也不是唯一的分离依据，有些相对分子质量相同而分子形状不同的物质也可以分离（如图4-4所示）。

分配系数Ka可用下式表示：

式中，Ve——洗脱体积，表示某一组分从进入层析柱到最高峰出现时，所需的洗脱液体积；

Vo——外体积，即层析柱内凝胶颗粒空隙之间的体积；

Vi——内体积，即层析柱内凝胶颗粒内部孔穴的体积。(www.xing528.com)

图4-4　凝胶层析示意图

当某一组分的Ka=0时，即Ve=Vo，说明该组分完全不能扩散到凝胶内部孔穴，洗脱时最先流出；Ka=1时，即Ve=Vo+Vi，说明该组分可以自由地扩散到凝胶内部的所有孔穴，洗脱时最后流出；Ka为0～1时，说明该组分分子大小介于大分子和小分子之间，洗脱时按照Ka值由小到大的顺序先后流出。

常用的凝胶有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等，它们的共同特点是内部具有多孔的网状结构。葡聚糖凝胶一般是由相对分子质量4×104～20×104的葡聚糖单体与交联剂1，2-环氧氯丙烷交联聚合而成，具有良好的化学稳定性，在碱性条件下非常稳定，在酸性条件下也具有较高的稳定性，并可耐120℃高温。琼脂糖凝胶是从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后，剩下的不含磺酸基和羧酸基等带电荷基团的中性部分，结构是链状的聚半乳糖，易溶于沸水，冷却后可依靠糖基间的氢键形成网状结构的凝胶，其网孔大小和机械强度取决于琼脂糖浓度。聚丙烯酰胺凝胶是人工合成的，由丙烯酰胺（H2C=CH—CONH2）与交联剂甲叉双丙烯酰胺（H2C=CH—CONH—CH2—HN—COCH=CH2）共聚而成，一般在pH值为2～11时内使用，强酸会使酰胺键水解而破坏其结构。

选择凝胶的主要依据是预分离组分的相对分子质量大小。凝胶颗粒的直径大小对层析柱内溶液的流速有一定影响。粗颗粒凝胶流速快，洗脱峰平坦，分辨率低，要采用直径较小的层析柱；细颗粒凝胶流速慢，洗脱峰越窄，分离效果好，采用较大直径的层析柱即可。另外，凝胶颗粒大小应当比较均匀，否则流速不稳定，会影响分离效果。

在使用前，凝胶需要进行一定的预处理。商品凝胶分为干胶和湿胶两种类型，湿胶不需要溶胀，但要去除悬浮杂质和防腐剂。干胶要浸泡溶胀，室温溶胀时间太长，一般采用热水溶胀，即将凝胶颗粒加入洗脱液中，在沸水浴中升温至接近沸腾，只需2～3h就可充分溶胀，同时达到灭菌消毒和排除凝胶内气泡的目的。不同的凝胶处理方法存在差异，可参考各商品凝胶的说明书。

将溶胀好的凝胶装入层析柱中，注意凝胶分布要均匀，不能有气泡或裂纹。上柱混合液的体积通常为凝胶床体积的10%左右，不能超过30%，混合液浓度可以适当高些，但其黏度宜低。然后，加入洗脱液进行洗脱。洗脱液体积一般为凝胶床体积的120%左右。洗脱液与干凝胶溶胀和装柱平衡时用的溶液一致。经过洗脱后，样品中各组分按相对分子质量由大到小的顺序流出层析柱，分开收集进行检测和回收。

除了进行物质分离外，凝胶层析还可以测定相对分子质量。对同类型物质，凝胶层析的洗脱特性与组分的相对分子质量呈线性关系。组分的洗脱体积Ve与相对分子质量Mr的关系可用下式表示：

式中，K1，K2为常数。

以组分的洗脱体积（Ve）对组分的相对分子质量的对数（lgMr）作图，通过测定某一组分的洗脱体积，从图中查出该组分的相对分子质量。

4.亲和层析

生物分子间存在许多特异性的相互作用，如酶-底物或者抑制剂、酶-辅助因子、抗原-抗体、激素-受体等生物分子对之间具有的专一而可逆的结合力就是亲和力。亲和层析就是利用生物分子间这种特异的亲和力而进行生物分子分离纯化的技术。

将生物分子对中的一个固定在不溶性基质上，利用特异而可逆的亲和力对另一个分子进行分离纯化。不溶性基质又称为载体或担体，一般采用葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶或者纤维素作为载体。被固定在载体上的分子称为配体，配体除了能与生物分子对中的另一个分子结合外，还必须与基质共价结合。载体一般需要进行活化处理，引入活泼基团，才能与配体偶联或者通过连接臂与配体偶联，常用的方法有叠氮法、溴化氰法、高碘酸氧化法、甲苯磺酰氯法、环氧化法、双功能试剂法等。将配体固定到载体上的方法也有多种，包括载体结合法、物理吸附法、包埋法和交联法等。当用小分子物质作为配体时，由于载体的空间位阻效应，难以与配对的大分子亲和结合，需要在载体和配体之间引入适当长度的连接臂，以减少载体的空间位阻。

在进行亲和层析时，首先要根据欲分离物质的特性，寻找能够与之识别和可逆性结合的物质作为配体，然后根据配体分子的大小及所含基团的特性选择适宜的载体，在一定条件下，使配体与载体偶联，将配体固定化，得到载体-配体复合物，就可以将其装入层析柱内进行亲和层析了。当样品溶液通过层析柱时，待分离的物质就与配体发生特异性结合而“吸附”到固定相上，其他不能与配体结合的杂质则随流动相流出，然后用适当的洗脱液将结合到配体上的待分离物质洗脱下来，这样就得到了纯化的待分离物质。

由于生物分子对之间的结合是专一性的，选择性很好，因此亲和层析的特点就是提纯步骤少。但是，亲和层析所用介质价格昂贵，且处理量不大，目前主要应用于实验室研究中。

5.高效液相色谱

高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）是一种柱色谱，能用一定的溶剂溶解的物质，都可用高效液相色谱分离，以液体为流动相，通过高压输液泵将待分离样品、缓冲液等泵入色谱柱中，样品中各组分被分离后，进入检测器完成检测，并通过数据处理系统分析结果，同时，各组分还可通过部分收集器回收。

高效液相色谱仪一般由溶剂槽、高压输液泵（有一元、二元、三元、四元等多种类型）、色谱柱、进样器（有手动和自动两类）、检测器（常用的有紫外检测器、示差折光检测器、荧光检测器、电化学检测器等）、馏分收集器、数据处理系统等组成。其核心部件是耐高压的色谱柱，通常由优质不锈钢管制成，也可由玻璃管或钽管制成，并且其他组成元件也都要用耐高压材料制作。柱中装有粒径很小的填充材料，当填充材料的粒径大于30 μm时，采用内径2 mm的色谱柱；当填充材料的粒径小于10 μm时，采用内径3～4mm的色谱柱。色谱柱的内径越小，分离效率和重复性越好。选用的填充材料不同，分离的原理也不同，可以分为以下几种类型：液-液分配色谱、液-固吸附色谱、离子交换色谱、凝胶渗透色谱等。

高效液相色谱法有“三高一广”的特点：①高压：液体流动相流经色谱柱时受到较大的阻力，必须对其加以高压，使其能迅速通过色谱柱。②高效：分离效率高。通过选择固定相和流动相从而达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效率高得多。③高灵敏度：紫外检测器可达0.01 ng，进样量在μL数量级。④应用范围广：70%以上的有机化合物可用HPLC分析，特别适合高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物的分离分析。此外，高效液相色谱法还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点。

但HPLC也有缺点，即“柱外效应”，在进样器到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（包括进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有任何变化，以及被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，降低分离效率。

6.薄层层析

薄层层析是在支持板（一般是玻璃板）上均匀地涂布一层薄薄的支持物（固定相），将待分离样品点在薄层板的一端，用适当的溶剂展开，从而使各组分得到分离的一种层析方法。

使用的支持物种类不同，其分离原理也不同，有吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析等。用硅胶、聚酰胺、氧化铝等做支持物，主要依据吸附力不同而进行层析分离，称为薄层吸附层析；用纤维素、硅藻土等做支持物，主要依据分配系数不同而进行层析分离，称为薄层分配层析；用离子交换剂做支持物，主要依据离子交换作用不同而进行层析分离，称为薄层离子交换层析；用葡聚糖凝胶等凝胶做支持物，主要依据相对分子质量大小不同而进行层析分离，称为薄层凝胶层析。应用时，需要根据欲分离样品的种类选择合适的支持物，支持物的颗粒大小要适当、均匀。颗粒大有利于提高展开速度，但是颗粒过大，展开速度过快会影响分离效果；颗粒也不能太小，否则会出现拖尾现象。另外，根据欲分离物质的性质，可以选择不同的展开剂和显色剂。

薄层层析设备简单，操作简便，分离快速灵敏。样品用量一般为几微克至几百微克，也可用于分离制备较大量的样品，即使用较大较厚的薄层板。配合薄层扫描仪，可以同时用于定性和定量分析，在生物化学、植物化学、石油、化工、医药等领域是一类广泛应用的物质分离方法。

7.聚焦层析

聚焦层析是将蛋白质等两性物质的等电点（pI）特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离的技术。在层析系统中，柱内要装上多缓冲离子交换剂，当含有两性电解质载体（由相对分子质量不同的多种组分的多羧基多氨基化合物组成）的多缓冲液流过层析柱时，在层析柱内形成稳定的pH梯度。欲分离样品液中的各个组分在此系统中会移动到与其pI相当的pH位置上，从而使不同等电点的组分得以分离。

多缓冲离子交换剂和多缓冲液是为聚焦层析专门开发的。PBE 118和PBE 94是两种pH交换范围不同的多缓冲离子交换剂，它们分别适用于等电点在pH8～11和pH4～9的两性电解质的分离。这两种离子交换剂是以交联琼脂糖6B为母体，并通过醚键在其糖基上偶合配基制成的。多缓冲离子交换剂要与其匹配的多缓冲液一起使用才能发挥效用。多缓冲液PB 96和PB 74分别适用于pH 9～6和pH7～4的聚焦层析，与它们相匹配的多缓冲离子交换剂是PBE 94。如需进行pH 9以上的聚焦层析，则选用多缓冲离子交换剂PBE 118和含有pH 8～10.5的两性电解质载体的多缓冲液。

聚焦层析系统中的pH梯度是利用多缓冲离子交换剂本身的带电基团的缓冲作用而自动形成的。例如，选用阴离子交换剂PBE 94作为固定相，PB 96为流动相，先用pH 9的起始多缓冲液平衡到pH 9，再用pH 6的多缓冲液通过层析柱，开始时流出液pH值接近9，随着多缓冲液的不断冲洗，流出液的pH值不断下降，最后流出液的pH值达到6，层析柱内就形成了从pH 6～9的连续升高的梯度。

蛋白质所带电荷取决于它的pI和层析柱中的pH值。待分离样品液加入层析柱后，当柱中的pH值低于蛋白质的pI时，蛋白质带正电荷，且不与阴离子交换剂结合。而随着洗脱剂向前移动，固定相中的pH值是随着冲洗时间延长而变化的。当蛋白质移至环境pH值高于其pI时，蛋白质由带正电变为带负电，并与阴离子交换剂结合。由于不同的蛋白质具有不同的pI，因此它们与阴离子交换剂结合时移动的距离是不一样的。随着洗脱过程的继续进行，当蛋白质周围的环境pH值再次低于pI时，它又带正电荷，并从交换剂上解吸下来。随着洗脱液向柱底的迁移，上述过程将反复进行，于是各种蛋白质就被洗下来，pI大的先流出，pI小的后流出。洗脱完成后，对多缓冲离子交换剂进行再生，可以反复使用。先用pH值=9的起始多缓冲液平衡，然后用pH 6的多缓冲液通过层析柱，直至流出液pH值由9降到6为止。