生物芯片是20世纪90年代初发展起来的一种全新的微量分析技术。生物芯片是指通过光导原位合成方式将大量生物分子有序固化在支持物表面，然后组成密集二维分子并排列，与已标记的待测生物样品杂交，最后通过特定仪器的高效扫描和计算机数据分析计算等构建的生物学模型。生物芯片技术的最大特点是高通量并行分析，它综合了分子生物技术、微加工技术、免疫学、化学、物理、计算机等多项学科技术，使生命科学研究中不连续的、离散的分析过程集成在芯片上完成。芯片上集成了成千上万密集排列的分子微阵列或分析元件，能够在短时间内分析大量的生物分子，快速准确地获取样品中的生物信息，检测效率是传统检测手段的成百上千倍。这门新兴技术的出现为生命科学研究、食品卫生检验、疾病诊断与治疗等领域带来一场革命。
（一）生物芯片的原理
生物芯片采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄像机，对杂交信号的强度进行快速、并行、高效的检测分析，从而判断样品中靶分子（细胞、蛋白质、基因及其他生物组分）的数量。
（二）生物芯片的工作流程
1.构建芯片
构建芯片是通过表面化学方法和组合法来处理芯片，然后将基因片段或蛋白质等生物分子按照顺序排列在芯片上，由于芯片种类较多，所以制备方法各不相同，主要有微矩阵点样法和原位合成法两种。
2.样品制备阶段
生物样品往往是非常复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，因此需要对样品进行生物处理（如提取、扩增），以获取其中所需的蛋白质或DNA、RNA等，并对其进行荧光标记，作为后续反应的检测信号。
3.生物分子反应
这一步骤是芯片检测比较关键的一步，但这个过程本身非常复杂，其复杂程度和具体控制条件是根据芯片的种类而决定的，若检测DNA表达，则反应必须在盐浓度高、温度低的环境下进行；若检测蛋白质，则必须满足是抗体和抗原特异性反应所需的条件。也就是说，通过选择合适的反应条件使生物分子间反应处于最佳状况，减少生物分子之间的错配比率，从而获取最能反映生物本质的信号。
4.反应图谱的检测和分析
将芯片置于芯片扫描仪中，通过扫描以获得有关生物信息，然后利用计算机软件所得数据进行分析处理。
（三）生物芯片主要特点
1.高通量
提高实验进程，利于显示图谱的快速对照和阅读。
2.微型化
减少试剂用量和反应液体积，提高样品浓度和反应速度。
3.自动化
降低成本和保证质量。
（四）生物芯片的分类
目前常见的生物芯片分为三大类：即基因芯片、蛋白质芯片、芯片实验室。近期又出现了细胞芯片、组织芯片、糖芯片以及其他类型生物芯片等。
1.基因芯片
基因芯片（gene chip）又称DNA芯片（DNA chip）、DNA微阵列（DNA microarray），是生物芯片技术中发展最成熟以及最先进入应用和实现商品化的领域。基因芯片是基于核酸互补杂交原理研制的，该技术系指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于400）已知碱基顺序的DNA片段（基因探针）固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。通俗地说，就是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的DNA探针，有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，与计算机的电子芯片十分相似，所以被称为基因芯片。基因芯片主要用于基因检测工作。通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如各种特定基因序列的检测、基因突变和单核苷酸多态性检测，也可用于基因序列测定，也开发用于转基因产品的检测。
基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交（Southern Blotting和Northern Blotting等）技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。
（1）基因芯片可分为三种主要类型
①固定在聚合物基片（尼龙膜，硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。这种方法的优点是所需检测设备与目前分子生物学所用的放射显影技术相一致，相对比较成熟。但芯片上探针密度不高，样品和试剂的需求量大，定量检测存在较多问题。
②用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。这种方法点阵密度可有较大的提高，各个探针在表面上的结合量也比较一致，但在标准化和批量化生产方面仍有不易克服的困难。
③在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。该方法把微电子光刻技术与DNA化学合成技术相结合，可以使基因芯片的探针密度大大提高，减少试剂的用量，实现标准化和批量化大规模生产，有着十分重要的发展潜力。
（2）基因芯片技术的操作原理 基因芯片技术的操作原理分为两部分：芯片的制备和样本的检测。
①基因芯片的制备：根据需要检测的外源目标基因设计寡核苷酸探针，用于制备基因芯片。在制备寡核苷酸探针时，一般在其5′或3′端进行氨基修饰，以利于其在玻片表面的固定。另外，对玻片表面进行氨基修饰，然后在氨基修饰后的玻片表面上连接双功能偶联剂，如戊二醛（GA）或对苯异硫氰酸酯（PDC），制备成基片。探针合成好后，通过点样仪点在基片上，寡核苷酸的修饰氨基将与基片上的戊二醛的另一个醛基发生化学反应，或与PDC分子的另一个异硫氰基发生类似的反应，从而达到寡核苷酸交联固定的目的。为了有利于寡核苷酸探针分子和目标基因片段之间的杂交，通常在所设计的寡核苷酸探针序列的5′端或3′端通常要加入一段不直接参与杂交的重复序列，称为手臂分子。采用poly（dT）10作为手臂分子。点样完成后要对芯片进行后处理，后处理的目的主要是为了使探针能与载体表面牢固结合，同时，还对载体上未与探针结合的游离活性基团进行封闭以避免在杂交过程中非特异性的吸附对实验结果（特别是背景）造成影响。
②样本的检测：包括样品制备和标记、杂交反应、信号检测和结果分析。
样品制备和标记：提取纯化样品核酸，尽量去除样品中的抑制物杂质，为了提高检验灵敏度，在对样品核酸进行荧光标记时。需要对待检靶标DNA进行PCR扩增。目前普遍采用的荧光标记方法有体外转录（NASBA）、PCR、逆转录（RT）等。目的是在以样品为模板合成相应核酸片段过程中掺入带有荧光标记的核苷酸，作为检测信号源。
杂交反应：杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行杂交产生一系列信息的过程。在合适的反应条件下，靶基因与芯片上的探针根据碱基互补配对形成稳定双链，未杂交的其他核酸分子随后被洗去。必须注意的是标记核酸样品必须变性成单链结构才能参与杂交。因此在杂交之前需要对标记样品进行变性处理，一般采用高温（95～100℃）沸水浴10min然后冰浴骤冷的方法。影响杂交效果的主要因素有杂交温度、杂交时间、杂交液的离子种类和强度等。杂交条件的选择与研究目的有关，如检测基因的差异性表达需要较低温度、长的杂交时间、高严谨性、高的样品浓度，以利于增加检测特异性和检测低拷贝基因的灵敏度；检测基因突变体和单核苷酸多态性（SNP）分析时，要鉴别出单个碱基错配，杂交时需要更高的杂交严谨性和更短的杂交时间。此外还需要考虑探针的GC含量、杂交液的盐浓度、探针与芯片之间连接臂的长度、待检基因的二级结构等因素。一般基因芯片产品对适用范围、杂交体系和杂交条件均有较为详尽的说明。
信号检测：当前主要的检测手段是荧光法和激光共聚焦显微扫描。杂交完成后，将芯片插入扫描仪中对片基进行激光共聚焦扫描，已与芯片探针杂交的样品核酸上的标记荧光分子受激发而产生荧光，用带滤光片镜头采集每一点荧光，经光电倍增管（PMT）或电荷偶合元件（CCD）转换为电信号，计算机软件将电信号转换为数值，并同时将数值大小用不同颜色在屏幕上显示出来。荧光分子对激发光、光电倍增管或电荷偶合元件都具有良好的线性响应，所得的杂交信号值与样品中靶分子的含量有一定的线性关系。
结果分析：由于芯片上每个探针的序列和位置是已知的，对每个探针的杂交信号进行比较分析，最后得到样品核酸中基因结构和数量的信息。
（3）基因芯片技术的特点
①样品制备时，在标记和测定前通常要对样品进行一定程度的扩增，以便提高检测的灵敏度。
②探针的合成和固定比较复杂，特别是对于制作高密度的探针阵列。
③目标分子的标记是一个重要的限速步骤。
④基因芯片检测结果的可靠性与探针种类及其特异性密切相关。
2.蛋白质芯片
蛋白质芯片是指固定于支持介质上的蛋白质构成的微阵列，又称蛋白质微阵列（Pro-tein Microarray），它利用的不是碱基对，而是抗体与抗原结合的特异性，即免疫反应来检测的芯片。蛋白芯片技术的研究对象是蛋白质，其原理是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定其上（如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等），根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白（存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等），经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析；它为获得重要生命信息（如未知蛋白组分、序列，体内表达水平生物学功能、与其他分子的相互调控关系、药物筛选、药物靶位的选择等）提供有力的技术支持。
（1）蛋白质芯片的制备原理
①固体芯片的构建，常用的材质有玻片、硅、云母及各种膜片等。理想的载体表面是渗透滤膜（如硝酸纤维素膜）或包被了不同试剂（如多聚赖氨酸）的载玻片。外形可制成各种不同的形状。
②探针的制备，低密度蛋白质芯片的探针包括特定的抗原、抗体、酶、吸水或疏水物质、结合某些阳离子或阴离子的化学基团、受体和免疫复合物等具有生物活性的蛋白质。制备时常常采用直接点样法，以避免蛋白质的空间结构改变。保持它和样品的特异性结合能力。高密度蛋白质芯片一般为基因表达产物，如一个cDNA文库所产生的几乎所有蛋白质均排列在一个载体表面，其芯池数目高达1600个/cm2，呈微矩阵排列，点样时须用机械手进行，可同时检测数千个样品。
③生物分子反应，使用时将待检的含有蛋白质的标本，按一定程序做好层析、电泳、色谱等前处理，然后在每个芯池里点入需要的种类。一般样品量只要2～10μL即可。根据测定目的不同可选用不同探针结合或与其中含有的生物制剂相互作用一段时间，然后洗去未结合的或多余的物质，将样品固定等待检测即可。
④信号检测分析，直接检测模式是将待测蛋白用荧光素或同位素标记，结合到芯片的蛋白质就会发出特定的信号，检测时用特殊的芯片扫描仪扫描和相应的计算机软件进行数据分析，或将芯片放射显影后再选用相应的软件进行数据分析。间接检测模式类似于ELISA方法，标记第二抗体分子。以上两种检测模式均基于阵列为基础的芯片检测技术。该法操作简单、成本低廉，可以在单一测量时间内完成多次重复性测量。
（2）蛋白质芯片技术的特点
①能够快速并且定量分析大量蛋白质。
②蛋白质芯片使用相对简单，结果正确率较高，只需对少量血样标本进行沉降分离和标记后，即可加于芯片上进行分析和检测。
③相对传统的酶标ELISA分析，蛋白质芯片采用光酶染料标记，灵敏度高，准确性好。另外，蛋白质芯片所需试剂少，可直接应用血清样本，便于诊断，实用性强。
蛋白质芯片在食品分析方面具有较好的应用前景，食品营养成分的分析（蛋白质），食品中有毒、有害化学物质的分析（包括农药、重金属、有机污染物、激素），食品中污染的致病微生物的检测，食品中污染的生物毒素（细菌毒素、真菌毒素）的检测等大量工作几乎都可以用蛋白质芯片来完成。
3.芯片实验室
芯片实验室（Lab－on－a－chip）或称微全分析系统（Micro Total Analysis System，或microTAS）是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离检测等基本操作单位集成或基本集成于一块几平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。它是通过分析化学、微机电加工（MEMS）、计算机、电子学、材料科学与生物学、医学和工程学等交叉来实现化学分析检测即实现从试样处理到检测的整体微型化、自动化、集成化与便携化这一目标。计算机芯片使计算微型化，而芯片实验室使实验室微型化，因此，在生物医学领域它可以使珍贵的生物样品和试剂消耗降低到微升（μL）甚至纳升（nL）级，而且分析速度成倍提高，成本成倍下降；在化学领域它可以使以前需要在一个大实验室花大量样品、试剂和很多时间才能完成的分析和合成，将在一块小的芯片上花很少量样品和试剂以很短的时间同时完成大量实验；在分析化学领域，它可以使以前大的分析仪器变成平方厘米尺寸规模的分析仪，将大大节约资源和能源。芯片实验室由于排污很少，所以也是一种“绿色”技术。
芯片实验室的特点有以下几个方面：集成性，目前一个重要的趋势是：集成的单元部件越来越多，且集成的规模也越来越大。所涉及的部件包括：和进样及样品处理有关的透析、膜、固相萃取、净化；用于流体控制的微阀（包括主动阀和被动阀），微泵（包括机械泵和非机械泵）；微混合器，微反应器，还有微通道和微检测器等。
（五）生物芯片技术在食品检测中的应用
1.生物芯片技术在转基因食品检测方面的应用
就目前转基因食品检测中常用的ELISA和PCR技术而言，最大的缺陷是检测范围窄、效率低，无法高通量大规模地同时检测多种样品，尤其是对转基因背景一无所知的情况下，对各种候选待检基因序列或蛋白的逐一筛查几乎是不可能的。而目前正在研究的转基因产品所涉及的基因数量有上万种，今后都有可能进入商品化生产，显而易见，对进出口产品的检测，需要有更有效、快速、特别是高通量的检测方法，而新兴的生物芯片技术能较好地解决这一问题。刘烜等为提高对转基因大豆的监控能力，研究了转基因大豆基因芯片检测方法，根据转基因大豆中所转入的外源基因，选择CaMV35 S启动子、NOS终止子、NOS/EPSPE基因和内源Lectin基因设计特异性引物，采用多重PCR法对样品进行扩增，通过缺口平移法合成DIG－dUTP标记杂交探针，制备基因芯片。在对PCR反应和扩增产物与芯片杂交条件进行优化的同时，比较了芯片检测的特异性和重复性，对检测的灵敏度进行测试。结果表明，基因芯片方法具有较好的特异性和重复性，由于采用了多重PCR技术，一次可同时检测多个基因，提高了检测的灵敏度和效率。
2.生物芯片技术在食源性致病微生物检测方面的应用
目前，致病微生物的检测方法主要以国家标准为依据，主要是传统的分离培养、镜检观察、生化鉴定、嗜盐性试验与血清分型等方法。这些方法操作烦琐、耗时耗力，检测周期长。此外，免疫学检测技术也应用于致病微生物的检测，这类技术利用抗原抗体的特异性反应，并结合一些生物化学或物理学方法来进行检测，主要包括免疫荧光技术、免疫酶技术等。免疫学检测技术虽然所需设备简单，抗原抗体反应特异性强，但其检测灵敏度有时达不到实际检测或诊断的需要，且操作烦琐，时间长。基因芯片技术可以广泛应用于各种食源性致病菌的检测，该技术具有快速、准确、灵敏等优点，可以及时反映食品中微生物的污染情况。将常见致病微生物的特异基因序列制成相应的基因芯片，根据碱基互补配对原理与待测样品进行杂交，经过检测即可判断待测样品中相应致病微生物的含量。陈昱建立了一种检测和鉴定志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、大肠杆菌O157、霍乱弧菌、副溶血弧菌和单增李斯特菌的基因芯片方法，该方法以16S rDNA基因为靶基因，利用多重PCR扩增，与传统方法比较大大缩短了检测周期，且方法特异性强、灵敏。
（一）适用范围
转基因大豆（GTS－40-3-2）及其加工产品由单一作物种类组成的物种结构特异性基因的定性检测。
（二）实验原理
通过多重PCR扩增和基因芯片技术，可以检测转基因大豆（GTS－40-3-2）及其加工产品中由单一作物种类组成的物种结构特异性基因。
（三）术语
基片：基因芯片中用于固定探针的基质，通常采用标准的“载玻片或其他固体载体”，经过化学修饰制备而成。
基因芯片探针：基因芯片中固定于基质表面、能与样本DNA互补、用于探测样本DNA信息的核酸分子，本部分采用寡核苷酸片段作探针。
定位探针：是一段与待测基因无关的寡核苷酸，通过和标记的定位探针互补链杂交显示信号，用于点样矩阵的位置的确定。
阳性质控探针：用于样品抽提、PCR、杂交的反应体系的监控，一般用生物的管家基因来设计阳性质控探针。
阴性质控探针：是一段与待测基因无关的寡核苷酸，用于基因芯片非特异性杂交背景的监控。
基因芯片空白质控点：由不含核酸的点样液点制而成，用于基因芯片杂交背景的监控。
目标基因探针：用于检测目标基因序列的探针。
信噪比：是杂交信号值与杂交背景值的比值，由图像分析软件自动判读。
（四）主要试剂
使用的试剂应为不含DNA和DNase的分析纯或生化试剂。
（1）点样液0.2mol/L碳酸钠。
（2）基因芯片洗脱液0.2% SDS。
（3）基因芯片杂交液1% SDS，10×SSPE。
（4）阴性目标DNA对照 不含外源目标核酸序列片段的模板。可使用阴性标准物质，并与测试样品等同处理进行核酸提取及PCR扩增。
（5）CTAB提取缓冲液（pH8.0）称取4.00g CTAB，16.38g氯化钠，2.42g Tris，1.50g EDTA二钠，4.00g PVP－40，用适量水溶解后，调节pH，定容至200mL，高压灭菌。临用前按使用量加入β－巯基乙醇，使终浓度为2%。
（6）引物和探针 转基因大豆的引物序列和探针序列如表5-19所示，对照的引物和探针序列如表5-20所示。
表5-19 转墓因大豆物种结构特异性墓因检测的引物序列和探针序列
表5-20 阳性对照（18 S rRNA）引物序列和探针序列
（7）多重PCR反应体系 多重PCR反应体系的配制如表5-21所示。
表5-21 多重PCR反应体系
续表
注：反应体系中各试剂的量可根据反应体系的总体积进行适当调整。
（五）主要仪器设备
基因芯片点样仪；紫外交联仪；基因芯片扫描仪：要配备具有分析信噪比的软件；杂交仪；清洗槽；暗室。
（六）检测基因
本方法检测转基因大豆（GTS－40-3-2）及其产品中的Lectin、CaMV 35 S启动子、NOS终止子和CP4－EPSPS基因。
（七）检测灵敏度
本方法的检测灵敏度为0.5%。
（八）实验方法与步骤
1.CTAB法提取DNA
（1）称取100mg样品2mL Eppendorf离心管中，加入700μL CTAB缓冲液，涡旋振荡器混匀后于65℃温育30min，期间颠倒混匀离心管2～3次。
（2）加入700μL的三氯甲烷－异戊醇，涡旋振荡混匀后放置10min，期间颠倒混匀离心管2～3次；12000×g离心5min。
（3）转移上清液至1.5mL Eppendorf离心管中，加入0.6倍体积经4℃预冷的异丙醇，于－20℃下静置5min，12000×g离心5min，小心弃去上清液。
（4）加入70%乙醇1000μL，倾斜离心管，轻轻转动数圈后，4℃下8000×g离心1min，小心弃去上清液；加20μL RNase A酶（10μg/mL），37℃温育30min。
（5）加入600μL氯化钠溶液，65℃温浴10min。加入600μL三氯甲烷－Tris饱和酚，颠倒混匀后，12000×g离心5min，转移上层水相至1.5mL Eppendorf离心管中。
（6）加入0.6倍体积经4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀后，于4℃下静置30min；4℃下12000×g离心10min，小心弃去上清液。
（7）加入1000μL经4℃预冷的70%乙醇，倾斜离心管，轻轻转动数圈后，4℃下12000×g离心10min，小心弃去上清液；用经4℃预冷的70%乙醇按相同方法重复洗一次。室温下或核酸真空干燥系统中挥干液体。
（8）加50μL TE缓冲液溶解DNA，4℃保存备用。
注：转移上清液时注意不要吸到沉淀、漂浮物和液面分界层。每个样品提取时应做2个提取重复。
2.多重PCR扩增
（1）多重PCR反应参数 多重PCR反应参数为：50℃ 5min；94℃ 5min；94℃ 10s，55℃ 10s，72℃30s，35个循环；72℃ 10min；4℃保存。
注：不同的基因扩增仪可根据仪器的要求将反应参数做适当的调整。
（2）物种结构特异性基因检测多重PCR将转基因大豆的Lectin、CaMV 35S启动子、NOS终止子、CP4－EPSPS和18s rRNA的引物同时加入多重PCR反应体系中。
注：应做PCR试剂对照（即不含DNA模板的PCR扩增反应液试剂）。
3.PCR产物的沉淀
将多重PCR反应产物加2倍体积的无水乙醇、1/10体积的3mol/L NaAC（pH5.2），置于－20℃避光沉淀30min以上，供基因芯片杂交检测用。
4.杂交
（1）杂交反应 沉淀后PCR产物经13000r/min 15min离心，弃上清，避光晾干，加经55℃预热的杂交液6μL，混匀后95℃3min、0℃5min后全部转移到芯片的点样区域，加盖玻片。在杂交舱里加几滴水，以保持湿度。将芯片放入杂交舱，密封杂交舱，然后放进50℃水浴内保温1h。
（2）洗片 打开杂交舱，取出芯片，用0.2% SDS冲掉盖玻片，然后把芯片放入盛有0.2% SDS的染色缸，放置5min，用双蒸水冲洗两遍。室温避光干燥。
5.扫描检测
将杂交后的基因芯片放入扫描仪内扫描，并分析结果，控制扫描仪的软件应具有信噪比的分析功能。
6.扫描结果的判定
首先阴性质控探针杂交信噪比均值≤3.5，基因芯片空白质控点杂交信噪比均值≤3.5，阳性质控探针杂交信噪比＞5.0判定为杂交合格，在此基础上，目标基因探针杂交信噪比均值≥5.0判定为阳性信号，在3.5～5.0判定为可疑阳性，≤3.5判定为阴性。
7.可疑数据的确证
对于可疑的数据，确证实验按照转基因大豆GTS－40-3-2定量检测——实时荧光定量PCR技术进行。
（一）适用范围
肉及肉制品中沙门菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲杆菌和大肠杆菌O157：H17的基因芯片检测。
（二）方法提要
针对5种目标菌保守基因片段设计引物，提取待检样品增菌液的DNA为模板进行两个独立的多重PCR扩增。扩增产物与固定有5种目标致病菌特异性探针的基因芯片进行杂交，用芯片扫描仪对杂交芯片进行扫描并判定结果。阳性结果用传统方法确证。
（三）材料和设备
高压灭菌锅、恒温培养箱、微需氧培养装置、高速离心机（2000×g以上）、水浴锅（37、42、70℃）、PCR超净工作台、PCR仪、水平式电泳仪、凝胶成像分析系统、水浴摇床、基因芯片扫描仪、基因芯片清洗仪（可选）、芯片杂交盒、微量可调移液器和灭菌吸头（2、10、100、200、1000μL）、灭菌PCR反应管。
（四）培养基和试剂
1.缓冲胨水增菌液（BP）、四硫磺酸盐煌绿增菌液（TTB）、改良缓冲蛋白胨水（MBP）、增菌培养液（EB）、10%氯化钠胰蛋白胨大豆肉汤、弯曲杆菌增菌肉汤、电泳级琼脂糖。
2.改良E.C新生霉素增菌肉汤［m（EC）n］
胰蛋白胨20g、3号胆盐1.12g、乳糖5g、无水磷酸氢二钾4g、无水磷酸二氢钾1.5g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL，将上述成分溶于水后校正pH至6.9±1，分装后120℃灭菌15min，取出后冷却至室温，以过滤灭菌的新生霉素溶液20mg/L加入，使最终浓度为20μg/mL。
3.晶芯食源性致病微生物检测芯片试剂盒
博奥生物有限公司，可选用其他等效产品。
（1）PCR引物序列 引物序列如表5-22所示。
表5-22 PCR反应使用的引物序列
续表
注：对于核酸序列，除了A、C、G、T分别代表各种核酸之外，R代表G或A，Y代表T或C，S代表G或C，H代表A、C或T，N代表A、G、C、T中任意一种。
（2）芯片探针序列 芯片探针序列如表5-23所示。
表5-23 芯片表面包被的目标菌墓因探针序列
（3）缓冲液GA（25mmol/L EDTA和5% SDS，pH8.0）、缓冲液GB（5mmol/L盐酸胍）、去蛋白液GD（3mmol/L盐酸胍）、漂洗液PW（2mmol/L Tris缓冲液，pH7.5）、蛋白酶K、吸附柱CB3和收集管、Rnase A溶液、洗脱缓冲液TE（10mmol/L Tris缓冲液，pH8.0）、PCR MixⅠ、PCR MixⅡ、Taq酶（5U/μL）、PCR阳性质控基因组DNA（50ng/μL）、GoldView（GV）、2×PCR载样液、DNA分子量标记2000、洗涤液Ⅰ（2×SSC，0.2% SDS）、洗涤液Ⅱ（0.2×SSC）、检测芯片。(www.xing528.com)
（五）检测程序
基因芯片法检测肉及肉制品中常见致病菌的程序如图5-7所示。
图5-7 墓因芯片法检测肉及肉制品中常见致病菌的程序
（六）操作步骤
1.增菌培养
（1）沙门菌增菌 以无菌操作，称取剪碎后的瘦肉样品25g，置于灭菌均质杯内，加入25mL缓冲胨水增菌液，以8000～10000r/min均质1min，移入盛有200mL缓冲胨水增菌液的500mL广口瓶内，混合均匀，如pH低于6.6，用灭菌1mol/L氢氧化钠溶液，调pH至6.8±0.2，于37℃水浴培养4h（以增菌液达到37℃时算起），进行前增菌；其后，移取10mL转种于盛有100mL四硫磺酸盐煌绿增菌液的250mL玻璃瓶内，摇匀，于（42±1）℃培养（20±2）h，进行选择性增菌。
（2）单核细胞增生李斯特氏菌增菌 无菌取样品25g放入灭菌均质杯加225mL改良缓冲蛋白胨水中，充分均质。改良缓冲蛋白胨水225mL放（30±1）℃培养（25±1）h，吸取1mL，加入10mL增菌培养液（EB）中放（30±1）℃二次增菌（25±1）h。
（3）金黄色葡萄球菌增菌 无菌取样品25g放入灭菌均质杯，以8000r/min均质1min，加200mL 10%氯化钠胰蛋白胨大豆肉汤，（36±1）℃培养48h。
（4）空肠弯曲杆菌增菌 无菌取样品25g放入灭菌均质杯，加100mL弯曲杆菌增菌肉汤，轻柔振荡5min后，静置5min。取出过滤衬套，滤干内容物，滤液放入培养瓶中，放（36±1）℃培养4h前增菌，再放（42±1）℃培养24～48h。
（5）大肠杆菌 O157：H17增菌 无菌取样品25g放入灭菌均质杯，加225mL［m（EC）n］增菌汤，（41±1）℃培养18～24h。
2.细菌DNA提取
按试剂盒操作说明进行：
（1）取上述5种增菌培养液各1mL至一个10mL无菌离心管中混匀，从中取1mL至一个1.5mL无菌离心管中，2500r/min离心30s。取上清液800μL到另一新的离心管中，12000r/min离心1min。弃掉上清液，沉淀中加入180μL缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。37℃作用1～3h。加入20μL Rnase溶液，振荡15s，室温放置5min。
注：余下的混合增菌液应放入冰箱，以备后期芯片检测阳性样品的确证实验用。
（2）向管中加入20μL蛋白酶K溶液，混匀后加入220μL缓冲液GB，振荡15s，70℃放置20～30min。简短离心以去除管盖内壁的水珠。
（3）加220μL无水乙醇，充分振荡混匀15s。简短离心以去除管盖内壁的水珠。将全部液体转移到吸附柱中。
（4）向吸附柱中加入500μL去蛋白液GD，12000r/min离心30s，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。
（5）向吸附柱中加入700μL漂洗液PW，12000r/min离心30s。倒掉废液，吸附柱放入收集管中。
（6）向吸附柱加入700μL漂洗液PW，12000r/min离心30s，倒掉废液。
（7）吸附柱放回收集管中，12000r/min离心2min，去除吸附柱中残余的漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱放置2～3min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
（8）将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL经65～70℃水浴预热的洗脱缓冲液TE，室温放置2～5min，12000r/min离心30s。
（9）再次向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL经65～70℃水浴预热的洗脱缓冲液TE，室温放置2min，12000r/min离心2min。回收得到的DNA产物于－20℃冰箱保存备用。
（10）DNA结果检测 用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取物。细菌基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳，出现的电泳条带位置在10000bp以上，且清晰可见。
3.PCR扩增
（1）扩增 将提取的细菌基因组DNA同时用两个PCR反应体系进行扩增，电泳检测PCR扩增产物。PCR反应体系如表5-24、表5-25所示。
表5-24 PCR反应体系Ⅰ
表5-25 PCR反应体系Ⅱ
（2）PCR反应的循环参数94℃预变性5min；进入循环，94℃/30s、56℃/30s、72℃/1min 40s，共40个循环；最后72℃延伸7min。
（3）PCR扩增结果检测 PCR反应结束后取3μL扩增产物加入3μL 2×PCR载样液，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。若在1000～1500bp之间出现明显的扩增条带，即可进行芯片杂交实验。
注：如果在此片段范围内无可见扩增条带，同时阳性质控也无可见扩增条带，则可能为扩增失败，建议更换另一批次的PCR扩增试剂，重新扩增。
4.芯片杂交
（1）杂交体系配制 将杂交液置42℃水浴预热5min，杂交体系的配制如表5-26所示。
表5-26 杂交体系
（2）变性 将杂交体系95℃变性5min，冰浴5min。
（3）杂交 将杂交盒平放在桌面上，在杂交盒的两边凹槽内加入约80μL灭菌水，将固定有探针片段的芯片放入杂交盒内，芯片标签正面朝上；揭掉芯片盖片的塑料薄膜，放在芯片的黑色围栏上，凸块的一面对着芯片；然后从盖玻片的小孔缓慢注入15μL变性后的杂交液。不要振动盖玻片或芯片以避免破坏液膜。盖紧杂交盒盖，放入42℃恒温水浴中，静置，杂交2h以上。
5.芯片洗涤
按需要量配制好芯片洗液Ⅰ和洗液Ⅱ，并在42℃预热30min。取出杂交后芯片，将芯片放在预热好的洗液Ⅰ中，42℃水浴摇床振荡清洗4min，再转入预热好的洗液Ⅱ中，42℃水浴摇床振荡清洗4min。最后用42℃预热好清水中振荡清洗一次，清洗后的芯片经1500r/min离心1min以去除芯片表面的液体。此芯片可避光保存，在4h内扫描结果。
6.芯片扫描及结果判读
（1）芯片杂交结果扫描 使用微阵列芯片扫描仪对洗净杂交后的芯片进行扫描分析。
（2）结果的判定标准
①信号值≥背景信号平均值+4×背景信号值标准差，且信号值≥阴性对照信号平均值+4×阴性对照信号值标准差，探针杂交结果为阳性；
②背景信号平均值+2×背景信号值标准差＜信号值＜背景信号平均值+4×背景信号值标准差，且阴性对照信号平均值+2×阴性对照信号值标准差＜信号值＜阴性对照信号平均值+4×阴性对照信号值标准差，探针杂交结果为疑似；
③信号值≤背景信号平均值+2×背景信号值标准差，且信号值≤阴性对照信号平均值+2×阴性对照信号值标准差，探针杂交结果为阴性。
7.结果报告
若芯片检测结果为阴性，则结果报告为相应的微生物阴性；若检测结果为阳性或者疑似，则按传统方法确认。
1.采用间接竞争ELISA方法检测磺胺二甲嘧啶的主要影响因素有哪些？
2.影响荧光定量PCR检测准确性主要有哪些因素？
3.采用恒温核酸扩增（LAMP）法检测致病菌时如何避免假阳性或假阴性？
4.基因芯片法定性检测转基因食品时实验对照该如何设置？
1.酶联免疫吸附试验（ELISA）中应用最多的底物是（ ）。
A.邻苯二胺（OPD）
B.四甲基联苯胺（TMB）
C. ABTS
D.对硝基苯磷酸酯（p－NPP）
2.酶联免疫吸附试验属于（ ）。
A.免疫标记技术
B.直接凝集反应
C.间接凝集反应
D.沉淀反应
3.PCR实验中，其特异性决定因素为（ ）。
A.模板
B.引物
C. dNTP
D.镁离子
4.在PCR反应中，下列哪项可以引起非靶序列的扩增（ ）。
A. TaqDNA聚合酶加量过多
B.引物加量过多
C. A和B同时过多
D.缓冲液中镁离子含量过高
5.TaqDNA聚合酶酶促反应最快最适温度为（ ）。
A. 37℃
B. 50～55℃
C. 70～75℃
D. 80～85℃
6.（ ）是LAMP法实现扩增的关键所在。
A.模板加入量
B.引物设计
C. DNA聚合酶种类
D.镁离子浓度
7.LAMP法对RNA扩增时，特殊再加入的物质是（ ）。
A.BstDNA聚合酶
B.特异引物
C.逆转录酶
D.甜菜碱
8.进行LAMP反应的注意事项与PCR的相似，在保存反应试剂时需注意，一般反应试剂保存于（ ），未稀释的引物保存于（ ）。
A. 4℃
B.－20℃
C. 0℃
D.－80℃
9.下面哪种生物芯片不属于微阵列芯片（ ）。
A.基因芯片
B.蛋白芯片
C. PCR反应芯片
D.芯片实验室
10.通过（ ）技术与基因芯片技术，可以对转基因大豆及其产品物种类组成的物种结构特异性基因的定性检测。
A.热启动PCR
B.普通PCR
C.多重PCR
D.一步单管PCR
11.以下什么情况下，选择竞争法测抗体（ ）。
A.当检验各种蛋白质等大分子抗原时
B.当抗原材料中的干扰物质不易除去时
C.当小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点时
D.当不易得到足够的纯化抗原时
12.PCR技术扩增DNA，需要的条件是（ ）。
A.目的基因
B.引物
C. dNTP
D. DNA聚合酶等
E. mRNA
F.核糖体
13.以下哪种表述是正确的（ ）。
A. PCR反应体系中镁离子的作用是促进TaqDNA聚合酶活性
B.在定量PCR中，72℃这一步对荧光探针的结合有影响，所以去除，实际上55℃仍可充分延伸，完成扩增复制
C. PCR技术需在体内进行
D.市面上多数试剂用淬灭基团Q基团和报告基团R基团来标记荧光定量PCR
14.LAMP法引物设计时需要考虑的因素主要有（ ）。
A.引物的大小及引物结合区之间的距离
B.引物GC含量
C.引物二级结构
D.引物末端的稳定性
15.生物芯片的主要特点（ ）。
A.高通量
B.微型化
C.集成化
D.并行化
［1］GB/T 21319-2007动物源食品中阿维菌素类药物残留的测定酶联免疫吸附法［S］. 2007.
［2］《GB/T 19495·1、2、3、4、5、6、8-2004转基因产品检测通用要求和定义》等标准检测方法［S］. 2004.
［3］SN/T2415-2010进出口乳及乳制品中沙门氏菌快速检测方法实时荧光PCR法［S］. 2010.
［4］SN/T 2754.1-2011出口食品中致病菌环介导恒温扩增（LAMP）检测方法第1部分：金黄色葡萄球菌［S］. 2011.
［5］SN/T 2651-2010肉及肉制品中常见致病菌检测方法基因芯片法［S］. 2010.
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