辅助生育技术与Robert Edwards的贡献

23．1 人工授精

23．1．1 人工授精的适应证

23．1．2 常用人工授精方法

23．1．3 人工授精诱发排卵方案

23．1．4 精液标本的分析处理

23．1．5 人工授精的并发症

23．1．6 供精人工授精

23．2 体外受精和胚胎移植

23．2．1 适应证

23．2．2 治疗前准备

23．2．3 超促排卵

23．2．4 B超引导下穿刺取卵

23．2．5 体外受精

23．2．6 胚胎移植

23．2．7 影响体外受精－胚胎移植成功率的因素

23．2．8 胚胎冷冻

23．2．9 单精子卵泡浆内注射术

23．2．10 植入前遗传学诊断

23．2．11 辅助生育的其他方法

23．2．12 辅助生育技术对妇女健康/子代健康的影响

近40年来，辅助生育技术得到蓬勃的发展，成为治疗不孕不育的行之有效的工具。1978年，Patrick Steptoe和Robert Edwards合作，世界上第1例试管婴儿Louis Brown在英国出生。Robert Edwards由于在辅助生育方面的贡献，获得了2010年的诺贝尔医学奖。

早期辅助生育技术多采用自然周期监测排卵和取卵。20世纪80年代后，临床上开始使用氯米芬和HMG促排卵，以获得更多的卵子。1983年，第1例冷冻胚胎移植的试管婴儿成功；同年，供卵试管婴儿出生。1992年，单精子卵泡浆内注射术（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）受孕；2000年，首例来自冷冻卵子和冷冻精子的婴儿降生。我国大陆地区，1988年首例试管婴儿在北京医科大学第三医院诞生，1996年首例ICSI婴儿诞生于中山医科大学。

辅助生育技术是一个基于多种学科的交叉学科，主要包括了人工授精（artificial insemination）和体外受精－胚胎移植，并由此衍生出很多新技术、新方法。本章节主要就这两大类技术及重点涉及领域进行阐述。

23．1 人工授精

人工授精是通过非性交方法将处理过的精液置入女性生殖道内，根据精子的来源不同，分为夫精人工授精（artificial insemination by husband，AIH）和供精人工授精（artificial insemination donor）。其前提条件是经过子宫输卵管造影或其他检查证实输卵管通畅。随着精子处理和冷冻、促排卵技术的发展，人工授精的临床应用和成功率得到很大改善。目前临床妊娠率可以达到10％～20％。

23．1．1 人工授精的适应证

（1）男方因素

1）男方存在解剖异常，使得精子不能进入阴道，如严重尿道下裂、逆行射精等。

2）精神神经因素使得性生活不能正常进行，或有早泄、不射精等。

3）男方免疫因素，如出现血液或精液抗精子抗体阳性。

4）精液中度异常：如精子密度＜15× 106/ml，活动率减低，严重精液量减少，精液液化时间长或不液化等。

（2）女方因素

1）生殖道异常阻碍精子运行，如阴道与宫颈狭窄，性交时阴道痉挛导致性交困难等。

2）宫颈因素包括宫颈黏液异常、反复性交后试验异常等。

3）女方免疫因素，如出现抗精子抗体阳性等。

（3）不明原因不孕

23．1．2 常用人工授精方法

（1）宫颈周围或宫颈管内人工授精（intracervical insemination，ICI）：将处理后的精液0．5～1．0ml缓慢注入宫颈管内，其余精液置入阴道前穹窿。此法常用于宫腔内人工授精困难者。

（2）宫腔内人工授精（intra－uterine insemination，IUI）：人工授精前需将精子洗涤优化，然后将0．5～2．0ml精液通过导管注入宫腔，术后仰卧10～15分钟。此法的成功率较前者高。

23．1．3 人工授精诱发排卵方案

（1）自然周期：如排卵正常，在月经周期第10～12天开始B超监测卵泡发育及子宫内膜增长情况。当主导卵泡达到18～20mm、血雌二醇（E2）水平达270～300pg/ml、黄体生成素（LH）上升高于基础值2倍以上，可以考虑安排在12～36小时后进行宫腔内人工授精。

（2）氯米芬促排卵：适用于多囊卵巢综合征、继发性低促性腺激素（或正常促性腺激素）闭经等患者。氯米芬是一种非类固醇激素，临床常作为促排卵的首选药物。氯米芬的化学结构与己烯雌酚类似，半衰期为5天，进入血液循环后与雌激素受体结合力低于雌二醇，但在靶细胞的细胞核内作用时间更加持久；具有雌激素和抗雌激素作用，并以抗雌激素作用为主。氯米芬的作用机制依赖下丘脑－垂体－卵巢轴的正反馈和负反馈，主要是与内源性雌激素竞争结合雌激素受体，可能是通过竞争性结合下丘脑细胞内的雌激素受体。与此同时，抑制雌激素受体的补充，从而使靶细胞对雌激素不敏感，解除雌激素对下丘脑的负反馈作用，下丘脑释放更多的促性腺激素释放激素（Gn RH），刺激垂体释放更多的卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）和LH。FSH可以促使卵泡发育成熟，雌二醇水平的上升引起正反馈作用，促进下丘脑释放大量Gn RH，引起垂体释放LH和FSH达到峰值，最终诱发排卵。

氯米酚促排卵从小剂量开始，月经第5天起每天50mg，连续服用5天。如1～2个周期无效，可以加至每天100mg，连续服用5天。为了提高排卵和妊娠率，可以联合使用其他药物。

1）氯米芬联合人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）：适用于氯米芬有卵泡生长，但不能自发排卵的患者。在服用氯米芬后，通过B超检测排卵，待卵泡成熟时，一次性给予HCG 5 000～10 000IU，诱发排卵，24～36小时后宫腔内人工授精。

2）氯米芬联合雌激素：适用于单用氯米芬子宫内膜较薄、宫颈黏液量少而稠者，在卵泡发育过程中适当加用戊酸雌二醇每天1～2mg。

3）氯米芬联合人绝经后促性腺激素（human menopausal gonadotropin，HMG）/FSH＋HCG：在超促排卵中联合应用氯米芬和HMG/FSH，可以提高氯米芬的效率，同时降低HMG/FSH的费用。该治疗使用方法灵活多样，如氯米芬第5天起每天50mg， 5天后应用HMG/FSH每天75IU，待卵泡成熟时，给予HCG诱导排卵。

（3）促性腺激素促排卵：为提高妊娠率，对于排卵功能障碍使用氯米芬几个周期无效者，可以使用促性腺激素促排卵，以提高周期中卵子质量。促性腺激素包括FSH、LH和HCG。FSH和LH由垂体产生和释放，在绝经期妇女的血中水平很高，尿中有大量的FSH和LH，临床上使用的是从绝经妇女尿中提取的HMG和FSH，之后有纯化和重组的FSH，以及重组的LH。

FSH、LH和HCG都是糖蛋白激素，由两个非共价结合的含糖相同α亚单位和不同β亚单位组成，LH和HCG的β亚单位有80％的同源性。FSH的作用是促进卵泡募集和生长，促进颗粒细胞芳香化酶的活性，使雄激素转换为雌激素。FSH和LH有协同作用，可以刺激卵泡各种细胞的增殖和分化， LH刺激卵泡膜细胞产生雄激素，用以作为芳香化酶的底物。HCG结构和生物学上与LH相似，模仿LH峰诱导排卵，并促进黄体功能。临床上，促性腺激素主要用于下丘脑－垂体功能衰竭的替代治疗、下丘脑－垂体功能不全的刺激治疗等。

促性腺激素的使用方法灵活多样，临床上根据患者的不同情况，制订具体的治疗方案，常规从低剂量开始，即每天75IU。同时在使用过程中，通过B超监测卵泡生长状况和血中激素水平，随时调整剂量。

23．1．4 精液标本的分析处理

在宫腔内人工授精前2小时获取新鲜精液供处理，以得到符合要求的活动精子密度。将装有标本的容器放在摇动的工作台上，在室温或37℃下等待液化，一般需要5～30分钟。抗精子抗体阳性的患者需收集在含50％血清的HEPES－HTF液5ml中，立即进行检查和处理，减少或去除精浆内前列腺素、免疫活性细胞、抗精子抗体、细菌及碎片，降低精液的黏稠性，促进精子的获能，改善精子的授精能力。

冷冻精子技术为一些患者提供了保障生育的条件，包括需要进行放疗和化疗的患者、长期分居的夫妇等。人工授精也可以使用冷冻精子。冷冻精子解冻后需要达到以下标准：精子密度＞20×106/ml、存活精子＞20％、活动力为≥2级，梯度离心后精子回收在20万活精或以上，活动力为≥2级。在冷冻过程中可能对精子细胞膜造成一定程度的损伤，但有研究认为与新鲜精液宫腔内人工授精相比，使用冷冻精子的临床妊娠率没有差异。

23．1．5 人工授精的并发症

（1）卵巢过度刺激综合征：在宫腔内人工授精过程中发生率较低，中度卵巢过度刺激综合征发生率为1％。在使用促排卵药物时，需根据患者情况适当调整药物，特别是多囊卵巢综合征的患者，要控制用药起始剂量（具体的预防和治疗措施，详见“体外受精和胚胎移植”章节）。

（2）异常的妊娠结局：据报道，在促排卵周期进行宫腔内人工授精时，多胎妊娠率约为20％，自然流产率为20％。

（3）盆腔感染：较为少见，操作时需掌握无菌技术。

23．1．6 供精人工授精

供精人工授精是通过非性交的方法，将供精者的精子在合适的时间置入女性生殖道内，以达到受孕目的的技术。供精人工授精适用于各种原因所导致的无精子症，特别是非梗阻性无精子症、睾丸穿刺未见精子者，或男方有遗传性疾病如精神病、癫痫等，或者夫妇因特殊血型导致严重母婴血型不合经治疗无效者。供精人工授精因涉及道德、法律和伦理等问题，需进行严格的随访和管理，我国规定必须按照相关管理条例严格执行。

23．2 体外受精和胚胎移植

体外受精和胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF－ET），是将不孕症夫妇的卵子和精子在体外受精，发育成胚胎后再移植到子宫腔内继续生长发育的辅助生育技术，又称为“试管婴儿”。随着1978年世界上首例试管婴儿Louis Brown的出生， IVF－ET技术得到了全世界的广泛关注。近30多年来，辅助生育技术蓬勃发展，在传统IVF－ET技术的基础上，不断有更多新的内容和技术问世，如显微受精技术、胚胎冷冻和种植前遗传学诊断等。

23．2．1 适应证

（1）输卵管性的不孕症：输卵管性不孕症在临床上较为常见，是IVF－ET治疗的主要适应证之一。所谓输卵管性的不孕症，是指由于输卵管炎症、输卵管周围特别是输卵管伞端周围病变、输卵管妊娠或结扎术后引起的机械原因等，阻碍了精子的运送、卵子的摄取、卵子与精子的受精以及将受精卵运送到宫腔，或者由于输卵管积液产生的细胞因子影响精子和卵子受精的环境及胚胎的发育等所引起的不育状况。输卵管性不孕症患者可以选择手术治疗，但在手术难以奏效时，如双侧输卵管阻塞、严重盆腔粘连、输卵管整形或复通术后仍未受孕的患者，IVF－ET提供了一个妊娠的机会。不过需要注意的是，输卵管积液可能会对子宫内膜容受性产生影响，对胚胎产生毒性作用，从而降低IVF－ET的成功率。

（2）男性因素：因少、弱、畸形精子而行多次宫腔内人工授精未孕的患者，可以行IVF－ET治疗；或者因严重的少弱精症或梗阻性无精子症，可以采用ICSI。ICSI的产生和发展，为传统方法不能解决的男性不育症提供了生育的可能。

（3）子宫内膜异位症：严重的子宫内膜异位症，经药物和手术治疗无效者，可以通过IVF－ET技术助孕。在IVF－ET治疗过程中，严重的子宫内膜异位症会影响卵巢组织结构，从而可能增加超促排卵促性腺激素的剂量和使用时间，同时可能对获卵数和卵子的质量产生一定的影响。

（4）多囊卵巢综合征治疗无效者：排卵障碍、顽固性多囊卵巢综合征经多次促排卵治疗和宫腔内人工授精未孕者，可以选择IVF－ET治疗。

（5）原因不明的不孕和免疫性不孕：原因不明的不孕及免疫性不孕患者经其他治疗无效时，特别是经多次宫腔内人工授精而未孕者，可以选择IVF－ET治疗。治疗过程中有可能发现卵子质量问题，或者出现受精障碍。

23．2．2 治疗前准备

在辅助生育治疗前，应详细询问夫妇双方病史，包括既往疾病史、家族史等。同时，夫妇双方接受系统的全身检查，明确IVF、ICSI适应证，排除内科、外科疾病及肿瘤。

（1）女方检查

1）血内分泌检查：月经第3天血内分泌检查，包括FSH、LH、雌二醇、孕酮（P）、睾酮（T）、催乳素（PRL）、促甲状腺激素（TSH）等，了解卵巢储备功能，排除高泌乳素血症、高雄激素及甲状腺疾患等。近些年也有一些新的指标，如抑制素（inhibin）和抗苗勒管激素（Anti－Mullerian hormone，AMH）等。

2）B超检查：了解子宫及双侧卵巢情况，排除肿瘤、内膜息肉、输卵管积液等，观察卵巢基础窦卵泡数，必要时测量卵巢血流情况，了解卵巢储备功能。

3）全身检查：包括血尿常规、肝肾功能人类免疫缺陷病毒（HIV）、RPR、乙型肝炎、丙型肝炎、染色体、心电图、乳腺检查、宫颈涂片、白带常规、支原体、衣原体、淋病等。

4）宫腔镜：B超疑有子宫内膜息肉、宫腔粘连或疑有子宫内膜结核者，以及反复IVF－ET失败者，建议行宫腔镜检查。

5）腹腔镜检查及治疗：检查中发现有子宫肌瘤、卵巢囊肿、输卵管积液等需要手术时，在IVF－ET前行腹腔镜手术。

（2）男方检查

1）精液检查：在辅助生育前需行常规精液检查1～2次。

2）全身检查：包括血尿常规、肝功能、HIV、RPR、乙型肝炎、丙型肝炎、染色体、支原体、衣原体、淋病等。

23．2．3 超促排卵

（1）超促排卵方案：早期的IVF－ET治疗采用自然周期取卵，每个周期生长的卵泡只有一个，最终形成胚胎的机会及移植的数目都受到严格的限制，因而早期的成功率较低。随着超促排卵技术的应用和发展，目前大多数IVF中心使用不同的超促排卵方案以获得多个卵子和胚胎，提高了获卵数和有效胚胎数，从而极大提高了辅助生育技术的成功率。超促排卵技术为现代辅助生育技术的发展奠定了基础，成为现代辅助生育技术的常规和基础技术之一。超促排卵，即能控制的卵巢刺激（controlled ovarian hypersti－mulation），也就是使用促排卵药物，有控制地促进卵巢多个卵泡的生长、发育和成熟。超促排卵方案的选择需要综合考虑多种因素，通过评估患者卵巢储备功能决定方案和超促排卵药物剂量。其中，评估卵巢储备功能需要考虑患者的年龄、基础内分泌水平、B超窦卵泡数，并包括近年来一些新的指标，如inhibin和AMH等。目前使用的超促排卵方案主要有以下几种。

1）长方案：是较常用的方案，适用于大部分卵巢功能基本正常的患者，可以达到满意的妊娠率。长方案需要使用Gn RH激动剂。Gn RH是下丘脑脉冲式分泌的10肽激素，通过与垂体促性腺激素细胞表面的Gn RH受体结合，作用于腺苷酸环化酶和钙离子，促进FSH 和LH 的合成和释放。Gn RH的稳定性差，体内的半衰期很短，仅为2～4分钟。通过取代第6、10位的氨基酸，人工合成的Gn RH激动剂稳定性增强，半衰期延长，生物学效应增加。目前临床上有多种药物可以使用，如Triptorelin、Goserelin、Leuprolide等。

在IVF－ET的超促排卵中，Gn RH激动剂的作用机制是：大剂量的Gn RH激动剂与Gn RH受体结合，使得未结合的受体数量减少，垂体不能对内源性或外源性Gn RH进一步产生反应，从而使FSH和LH的分泌减少。一般用药后5～7天开始减少，14天作用降低至基础水平以下，达到降调节的作用，从而减少早发LH峰的发生，抑制内源性LH峰的出现。一般从前次月经黄体期给予Gn RH激动剂，可以使用长效制剂一次性注射，也可以使用短效制剂每天注射，在月经第3天起开始使用促性腺激素进行超促排卵。促性腺激素的剂量根据患者年龄、体重、卵巢储备功能等决定，超促排卵过程中须严密监测，并根据需要增加或减少促性腺激素的剂量，直到HCG注射日。

2）短方案：一般在月经第3天开始每天给予短效Gn RH激动剂，同时使用促性腺激素进行超促排卵，直到HCG日。Cochrane于2011年综述了Gn RH用于长方案和短方案的随机对照研究，发现长方案的临床妊娠率明显升高（OR1．50，95％CI：1．16～1．93），其获卵率明显升高，但促排卵药物的用量也明显增加，约增加12．9支药物，由于短方案有激发效应，目前短方案通常用于反应不良、卵巢储备功能较差的患者。短方案可以引起卵泡早期雌二醇、孕酮水平暂时升高，可能影响到子宫内膜容受性。亦有研究认为，对于卵巢低反应的患者，Gn RH激动剂短方案的临床继续妊娠率没有Gn RH拮抗剂方案高。

3）超短方案：适用于卵巢储备功能差的患者。在月经第3天每天给予Gn RH激动剂和促性腺激素，Gn RH激动剂仅使用5～6天即停止。

4）超长方案：适用于患有子宫内膜异位症的患者。治疗前给予2～3次长效Gn RH激动剂，在最后一次给药的4周后进行超促排卵。由于注射多次Gn RH激动剂，可能影响卵巢功能，必要时可以增加促性腺激素的起始剂量。

5）拮抗剂方案：Gn RH拮抗剂是较新应用于临床的药物。与Gn RH激动剂不同， Gn RH拮抗剂对Gn RH 10肽的1、2位氨基酸进行修饰，与Gn RH受体结合后，不产生信号传导，因而阻止Gn RH对垂体的作用。其特点是即刻产生抑制作用，没有Gn RH激动剂使用开始时的激发现象，同时可以减少卵巢过度刺激综合征的发生率。IVF－ET临床常用的有Centrorelix和Ganirelix等。目前一般使用连续给药方法，即在超促排卵的月经周期第7～8天或主导卵泡≥14mm时开始使用Centrorelix 0．2 5mg/d，直到HCG注射日。这种方法舒适方便。研究表明， Gn RH激动剂与拮抗剂方法的妊娠率相当，但也有认为拮抗剂的妊娠率稍低，但其优点是对于多囊卵巢综合征或其他卵巢高反应的患者，可以明显降低卵巢过度刺激综合征的发生率。

6）微刺激方案：月经周期第3天起使用氯米芬，然后使用HMG，这种方法用药费用低，对于卵巢储备功能差或为多囊卵巢综合征的患者是一个有效的选择方案。但有研究认为，由于氯米芬的使用使子宫内膜容受性不良，可以联合使用冷冻胚胎移植的方法。

（2）超促排卵的监测

1）超声监测：在使用Gn RH激动剂和促性腺激素前，以及使用促性腺激素3～5天后，定期对子宫、卵巢、卵泡发育情况进行监测，卵泡大小测量是取其最大断面互相垂直的两个径线的平均值。超声监测特点是方便、即时、无创、可重复。

2）血清LH、雌二醇、孕硐水平：雌二醇水平间接反映卵泡数量和大小，以及卵母细胞的质量。LH的监测是预防提前出现的内源性LH峰。多个卵泡发育成熟时可产生孕硐，孕硐水平的升高影响卵母细胞的质量和子宫内膜容受性。

3）HCG使用时机：需要根据超声监测和血液中激素水平来决定HCG使用时机。使用长方案、短方案等，在3个卵泡直径≥18mm时可以注射HCG；使用微刺激方案，可以在1个卵泡直径≥18mm时注射。如果内源性LH峰提前出现，可以考虑适当提早注射HCG的时间。

（3）卵巢过度刺激综合征的防治：卵巢过度刺激综合征是超促排卵的并发症之一，一般发生率为20％，中度、重度的发生率为1％～10％。妊娠者卵巢过度刺激综合征的发生率是非妊娠的4倍，且持续时间较非妊娠者长。高危患者包括年纪较轻、多囊卵巢综合征、雌二醇≥4 000pg/ml等。

1）发病机制：尚不清楚，可能与多种因素有关。有人认为，与LH及HCG激活卵巢肾素－血管紧张素－醛固酮系统、促进毛细血管通透性有关。HCG能调节血管内皮因子、增加血管通透性。同时，各种炎性介质及细胞因子可能也有一定作用。另外，卵巢过度刺激综合征一般发生在高雌激素水平的患者。

2）临床表现：由于毛细血管通透性增加，大量体液外渗引起腹腔积液、胸腔积液、血容量降低、少尿甚至无尿，伴有水和电解质紊乱、血黏度增加、凝血功能障碍，甚至血栓形成。根据病情可以分为以下3度。

轻度：出现下腹不适、胃纳差等，雌二醇＜5 500pmol/L，卵巢直径达5cm。

中度：有明显的下腹胀痛、恶心等，体重增加≤3kg，腹围明显增大，雌二醇＜11 000pmol/L，卵巢直径达5～10cm，腹腔积液＜1．5L。

重度：腹腔积液明显增加，腹胀加剧，甚至无法进食，乏力、虚弱、呼吸困难、不能平卧等，卵巢直径＜10cm，体重增加＜4．5kg，出现血液浓缩，电解质紊乱，肝、肾功能受损。

3）预防：由于病因不明，目前缺乏针对性强的治疗方法，应以预防为主。预防措施包括在超促排卵治疗时需要特别警惕高危对象，对于年轻、BM1偏小、多囊卵巢综合征等患者，促排卵药物起始剂量需相应减少，或者使用拮抗剂、微刺激方案等，治疗过程中密切监测，必要时降低促排卵药物的剂量。对于出现卵巢过度刺激倾向的患者，必要时考虑使用coasting疗法，即停用促性腺激素1～5天，减少HCG剂量至5 000IU，微刺激或拮抗剂方案使用Gn RH激动剂诱导排卵等。

4）治疗：由于发病机制不明，目前尚缺乏针对性的治疗方法。对于轻度患者需要密切观察，中、重度患者给予精神鼓励、建立信心；建议高蛋白饮食，少量多餐；使用低分子右旋糖酐等纠正低血容量，注意电解质平衡和血凝状态，可以使用前列腺素拮抗剂如吲哚美辛降低血管通透性；严重腹腔积液时可在B超引导下腹腔穿刺引流腹腔积液，改善患者症状；合并肾衰竭者，可以静脉滴注多巴胺。

（4）超促排卵的黄体支持：使用降调节的超促排卵方案，体内促性腺激素的分泌较低，加之穿刺取卵同时吸出了大量颗粒细胞，一般在胚胎移植后需要给予黄体支持。黄体支持的时间各IVF中心不同，从2周至3个月不等。

23．2．4 B超引导下穿刺取卵

目前广泛使用的B超引导下穿刺取卵术是一项安全、简便、有效的技术，也是IVF常规收集卵子的方法。

（1）麻醉：术前30分钟肌内注射哌替啶50～100mg；术时一般采用芬太尼静脉麻醉，由麻醉医师进行动态心电等监测。

（2）设备：B超、阴道探头及穿刺适配器、穿刺针、负压吸引器和一次性试管等。

（3）手术操作

1）阴道准备：患者术前排空膀胱，取膀胱截石位；用生理盐水反复冲洗阴道，消毒纱布擦干，铺消毒巾。

2）取卵：B超阴道探头涂耦合剂，套消毒的乳胶薄膜套；调出B超穿刺引导线；检查穿刺针与负压仪的连接，调节负压至适当压力；B超探头插入阴道后检查子宫、卵巢、盆腔情况，观察是否有异常排卵及盆腔是否有异常液性暗区。然后，将B超探头和穿刺引导线固定在穹窿组织与穿刺卵巢间最近距离，尽可能避开宫颈、子宫肌层和宫旁血管网；穿刺时进针快而准确，进入卵泡时启动负压吸引；B超尽量显示卵泡最大平面，针尖可以旋转，需彻底吸取卵泡内的卵泡液，直至卵泡完全塌陷。

同一穿刺线的卵泡由浅入深一次完成，然后将针退至卵巢表面，但不退出阴道壁；改变穿刺方向，穿刺另一条穿刺线的卵泡，尽可能穿刺所有10mm的卵泡；一侧卵巢穿刺结束后再穿刺另一侧卵巢。(www.xing528.com)

穿刺时观察负压情况，注意盆腔是否有出血，同时监测患者的生命体征；穿刺过程中需与实验室及时交流，了解术中检卵数与穿刺卵泡数是否一致，发现差异较大时应及时寻找原因。如果穿刺卵巢位置不能避开子宫肌层时，尽量避开穿过子宫内膜，以免影响移植。

穿刺取卵结束后，检查盆腔是否有出血、穿刺点是否有活动性出血；如无特殊情况，擦拭阴道，结束手术。若发现穿刺点有出血，可用棉纱填塞压迫止血，血止后取出，术后平卧休息，经手术医师检查正常方可离开医院。

23．2．5 体外受精

（1）卵子收集：在加热的显微镜平台上观察卵泡抽吸液；找到卵丘复合物时冲洗卵子，将血块与颗粒细胞分离；迅速将卵子移入37℃培养箱内。在收集卵子过程中，还需评估卵子成熟度和质量。

1）生殖泡：卵子未成熟。卵子周围有致密的颗粒细胞，有时可见生殖泡，一般无卵丘，放射冠比较致密。

2）减数分裂中期：卵子被放射冠细胞紧密包围，颗粒细胞间隙增大，卵泡浆中生殖泡消失，无第一极体排出。

3）减数分裂中期Ⅱ

● 排卵前卵子：放射冠细胞在卵子周围向四周放射性扩散，颗粒细胞扩展呈半透明的不定形体，第一极体出现。这种卵子成熟度最佳，容易受精。

● 卵子过熟：卵子呈苍白的球体，放射冠细胞数少或已经脱落，颗粒细胞仍较多。也可以发展到卵子周围颗粒细胞形成小而黑的滴状物。

● 黄素化卵子：卵子苍白，颗粒细胞裂解，形成胶状体包裹在卵子周围这时的卵子受精能力较低。

● 闭锁卵子：颗粒细胞破裂，呈花边状包围卵子，卵子较黑，较难确认。

（2）精子处理：精子的处理可以使用直接上游法或不连续浮力密度梯度法。一般推荐使用直接上游法，这种方法适用于精液常规正常的精液标本，在整个处理过程中只使用培养液，没有其他化学物质。

（3）体外授精（IVF）：一般按照每毫升10万条正常活动精子受精，200～250μl制成一个小滴，内放置1个卵子，即每个卵子加2万～2．5万条活动精子；亦有每个卵子加2万～5万条活动精子。通常采用微滴培养法或四孔板培养法。

（4）观察受精、胚胎发育情况：常规IVF的卵子需将颗粒细胞剥离后观察受精两原核的存在。剥离方法有针剥法和细管吹打法。原核观察在受精17～20小时进行。在受精的第2天和第3天，继续观察胚胎发育的情况；受精39～60小时可以观察到有活力的4细胞胚胎；72小时前观察到8细胞期胚胎。3、5和7细胞胚胎也很多见，特别是在有丝分裂过程中观察胚胎时。移植和冷冻前需对胚胎进行评分，根据评分选择良好的胚胎进行移植和冷冻。根据形态学参数，可以将早期胚胎分为0～Ⅵ级。

0级：未受精、未分裂。

Ⅰ级：同等大小分裂球，同质细胞质，无细胞质碎片（图5－23－1）。

Ⅱ级：有下列3种之一者，细胞质变黑，细胞大小不一或碎片＜20％（图5－23－2）。

Ⅲ级：碎片为 20％ ～50％ （图 5－23－3）。

Ⅳ级：碎片＞50％（图5－23－4）。

图5－23－1 Ⅰ级胚胎

图5－23－2 Ⅱ级胚胎

图5－23－3 Ⅲ级胚胎

图5－23－4 Ⅳ级胚胎

Ⅴ级：受精，未分裂。

Ⅵ级：全部都是碎片。

通常，Ⅰ级和Ⅱ级胚胎有良好的发育潜能，Ⅲ级胚胎发育潜能下降，Ⅳ级胚胎发育潜能较差，很难着床。胚胎评分手段是辅助生育中复杂的问题，目前多数采用形态学评分，但其他方法如培养基的代谢水平也日益受到关注。

也有将胚胎培养至囊胚（图5－23－5）进行移植。目的是形成比卵裂阶段具有更好发育潜能的胚胎，一般移植1～2个囊胚，以减少三胎妊娠率。

图5－23－5 囊胚

23．2．6 胚胎移植

取卵后于2～5天进行胚胎移植。根据卫生部《人类辅助生殖技术规范》的规定：“每周期移植卵子、合子、胚胎总数不超过3个，如行辅助生殖技术第一周期，患者年龄小于35岁，移植胚胎总数不超过2个。”胚胎移植过程通常在B超监测下进行，步骤如下。

患者摄取一定容量水后，取膀胱截石位，铺无菌巾；阴道窥器充分暴露宫颈，干棉纱拭净阴道和宫颈分泌物，用培养液拭净宫颈口分泌物；在B超监测下置入胚胎移植外管，一般外管末端与移植管内芯相聚1．5cm，移植管内芯距宫底为0．5～1．0cm。

移植管内芯接至1ml注射器上，装好胚胎后，通过外套管将移植管内芯向宫腔送入，将胚胎与移植液注入宫腔内。取出外管与内芯，显微镜下观察是否有胚胎存在，移植后让手术者休息一段时间即可离开医院。术后给予黄体支持。

IVF－ET的妊娠率与胚胎质量、评分、数量等有关，但盲目增加移植数量并不增加妊娠率，反而增加多胎的风险。移植后应注意各种并发症的发生，包括卵巢过度刺激综合征、多胎妊娠、宫外孕、宫内合并宫外妊娠等，如发现三胎或三胎以上妊娠，需要进行减胎术。

23．2．7 影响体外受精－胚胎移植成功率的因素

不同中心IVF－ET的妊娠率有所不同，主要是每个中心纳入的患者标准不同，从而使年龄、基础FSH值、以往IVF次数均不相同。同一中心影响IVF－ET成功的因素主要包括女方年龄、对超促排卵方案的反应、获得卵子数量和质量、精子质量、胚胎移植数量和质量等。

23．2．8 胚胎冷冻

人类胚胎冷冻技术起源于20世纪80年代，经过不断发展，这项技术已越来越完善，解冻后胚胎的存活率从原来的＜20％达到如今的90％左右，同时冷冻胚胎移植妊娠率也达到新鲜胚胎移植妊娠率的水平。目前，冷冻胚胎技术已经成为IVF治疗的重要部分，其不仅减少了患者费用，而且最大限度地提高了每次超促排卵和取卵周期可以利用的胚胎数，提高了单次取卵周期的妊娠率，降低了卵巢过度刺激新鲜胚胎移植的风险。在有些患者子宫内膜不同步或患者有突发情况时，胚胎冷冻也是一个选择方案。

（1）胚胎冷冻方法：以往的冷冻方法称为慢速冷冻法。在室温下，胚胎于低浓度的冷冻保护剂溶液中预平衡；再放置在终浓度的冷冻液里，在冷冻仪内预设的程序下逐渐降温；然后浸入液氮中。

目前很多中心已经使用玻璃化冷冻法，即在快速冷冻中由液态直接转为黏稠的玻璃状态或无冰晶结构的固态。这种方法操作简单，只需将细胞放入CPA中，然后置入液氮中即可。该过程细胞快速越过玻璃化临界点（水为－130℃），原来的液相液体转变为无定型的玻璃化固状，有效排除了细胞外冰晶形成阶段，减少了冷冻的损伤。解冻时根据冷冻速率和方式不同，采用适宜的复苏速率，减少冰晶的形成及溶质性损伤。冷冻速率越快，复温速率越快，反之亦然。

（2）冷冻胚胎移植周期的内膜准备

1）自然周期：月经规则的患者可以监测排卵和血中LH、雌二醇、孕酮的水平，在LH峰出现时，即比基础值上升2倍时，准备在72小时解冻移植胚胎。

2）垂体降调节加激素替代法：在患者前次周期黄体期使用Gn RH激动剂进行降调节。月经来潮后B超检查，内膜＜5mm时口服戊酸雌二醇或类似物，B超监测子宫内膜，同时观测血液中LH、雌二醇和孕酮水平。内膜＜8mm可以增加戊酸雌二醇剂量，同时可以加用阿司匹林等；周期第13天，内膜≥8mm时可以考虑准备移植胚胎；移植前2天开始使用黄体酮；通常在周期第15～21天进行移植。

（3）冷冻胚胎的安全性：研究表明，精子和胚胎冷冻5年不会发生退化。同时随访的数据表明，通过冷冻胚胎移植分娩的孩子先天性缺陷的发生率未明显增加。

23．2．9 单精子卵泡浆内注射术

（1）适应证：①严重男性少弱精症、畸形精症；②前次IVF受精失败或受精率＜30％；③植入前遗传学诊断（PGD）治疗周期；④无精症经睾丸活检有精子者，或附睾穿刺的精子。

（2）操作过程

1）卵子处理：常规IVF卵子是被卵丘复合体包围受精的。在ICSI前，需要去除卵子周围的卵丘和放射冠细胞，这对评估卵子的成熟度和准确进行精子注射非常重要。去除卵丘和放射冠第一步是将卵子放于含有80Iμ/ml透明质酸酶的HEPES缓冲液中，用Pasterur吸管反复吹打卵子；第二步是将卵子转移至无透明质酸酶的容器内，使用细长吸管进行机械裸化。裸化后的卵子进行观察评估细胞核成熟度。

2）精子处理：精子来源于新鲜射精、冷冻精子、附睾穿刺或睾丸活检等。新鲜射精的精子通过密度梯度离心法处理，极度少精症可以通过简单洗涤以减少精子损失，附睾穿刺的精子同极度少精症的处理。睾丸活检后需移去组织碎片。

3）显微注射：在带有显微注射操作仪的倒置显微镜下进行。首先选择一条活动形态正常的精子，用注射针将精子尾巴压在操作皿上进行制动，使用注射针从尾部吸入精子。然后对成熟的卵子（MⅡ期）进行固定，使得第一极体对准12点或6点位置。将精子调节到注射针顶端，从卵子3点处进针，轻轻回吸确定卵膜已经破裂，使用最小液体量将精子注射入卵子里，小心退出注射针，显微注射后可以看到卵浆中央有一个精子（图5－23－6）。

4）ICSI的结果：在ICSI后卵子转移至表面覆盖轻质液状石蜡的培养微滴中，放入培养箱。在ICSI 16～18小时观察胚胎受精情况；ICSI的第2～3天，发育至4细胞和8细胞期的为优良胚胎。胚胎移植策略同IVF周期，也有选择第5天囊胚期移植，特别是胚胎植入前遗传学诊断。随访数据表明，ICSI出生的婴儿与IVF出生婴儿相比，新生儿畸形和并发症并不增高。

图5－23－6 卵胞浆内单精子注射（ICSI）

23．2．10 植入前遗传学诊断

植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis，PGD）是辅助生殖技术与遗传学相结合的诊断技术，通过检测辅助生育中胚胎，挑选出无遗传缺陷的胚胎以供移植。

PGD可以通过3种途径检测，即检测第一和第二极体、卵裂期卵裂球活检和囊胚活检，目前常用的是卵裂球活检。获取的材料可用聚合酶链反应 （polymerase chain reaction，PCR）分析检测单基因缺陷，或者使用荧光原位杂交 （fluorescence in situ hybridization，FISH）检测染色体异常。FISH的优点是污染概率较低，检测快速，可以检测染色体倍数，排除非整倍体的胚胎。PGD用于检测染色体异位的患者如罗伯逊异位，可使染色体异位携带者获得健康的后代。另外，PGD还可以用于高龄孕妇，筛选正常倍体的胚胎以供移植，排除染色体倍体异常的胚胎，提高辅助生育的成功率，减少流产率。目前的数据表明，PDG出生婴儿先天缺陷的发生与正常人群相同。虽然PDG方法是安全的，但仍需要长期随访，确定其长期安全性。

另外，一些新技术和新方法也应用于PGD临床上。

（1）比较基因组杂交（comparative genomic hybridization，CGH）：其原理是提取待检测的单卵裂球或第一极体的DNA，同对照基因组DNA一起标记不同荧光后按1∶1比例混合，与正常染色体杂交，根据荧光不同判断基因组中相对应序列拷贝的变化。CGH的优点是可以检测所有染色体的数目，以及每条染色体全长的具体情况，能够检测出不常见的异常，如5号或9号染色体三体。CGH在PGD的应用方向是array－CGH，其杂交所需时间不到24小时，可以检测全基因组水平，以及更小范围的DNA变化，如染色体不平衡异位、纯合、杂交、缺失等。

（2）胚胎植入前遗传学筛查（preimplan－tation genetic screening，PGS）：主要用于高龄夫妇核型正常但反复自然流产、多次IVF失败、严重男性不育因素等患者。

23．2．11 辅助生育的其他方法

（1）未成熟卵的体外培养：Veek等于1982年首先成功获得人类未成熟卵体外培养后经体外受精发育的胚胎；1992年Cha等报道未成熟卵体外培养通过ICSI后形成胚胎，移植后获得临床妊娠。由于常规的IVF方法需要大剂量促性腺激素进行超促排卵，对于多囊卵巢综合征患者来说，卵巢过度刺激征的发生率增加，严重者需要入院治疗，甚至威胁生命安全。另外，有少数患者对于促排卵药物不敏感，或者不能接受促性腺激素治疗，未成熟卵的体外培养（in vitro maturation，IVM）为她们提供了希望。IVM临床上可以使用非刺激周期，或者仅使用低剂量促性腺激素的周期。在卵泡直径达到5～12mm时，注射HCG 10 000IU，36小时取卵。取卵时使用双腔针，每个卵泡反复冲洗2～3次。取卵前或取卵日开始口服雌激素，使子宫内膜达到8～10mm，ICSI日给予黄体酮40～60mg。未成熟卵的体外培养还有一些问题尚需解决，包括卵胞浆发育不成熟、子宫内膜与胚胎发育不同步及长期安全性等。

（2）卵母细胞的冷冻：在IVF治疗中，胚胎冷冻已经成为常规治疗的一部分。然而，有些情况需要冷冻卵母细胞，如取卵当天男方不能提供精子、为建立卵子库以备供卵、未婚妇女要求储备生育力（特别是化疗和放疗前）等。

卵母细胞是体内最大的细胞，其冷冻过程与胚胎冷冻有所不同。卵子细胞膜在受精前通透性差，在冷冻过程中应注意细胞脱水。另外，MⅡ期卵子核膜已经溶解，染色体处于纺锤体上；纺锤体对环境变化非常敏感，在外界环境剧烈变化及不适合的环境中，卵母细胞可以发生自发激活，影响其发育潜能。目前，卵子冷冻的稳定性不如胚胎冷冻，卵母细胞冷冻的研究和临床应用尚需进一步的探索。

（3）卵巢组织冷冻：卵巢组织冷冻为需要手术、放疗和化疗的恶性肿瘤患者提供了保存生育能力的希望。然而，卵巢组织冷冻比胚胎和卵子冷冻均要复杂得多。如何保持移植后卵巢组织的血供以维持其活力，如何选择最佳移植位点以及长期安全性等问题尚需解决。

（4）赠卵：卵子捐赠为原本根本不能妊娠的妇女提供了希望，适用于卵巢早衰、Turner综合征、X性连锁疾病、反复IVF失败的患者。2006年我国卫生部发布了《人类与人类精子库校验实施细则》要求：“一、已经审批开展人类辅助生殖技术的各机构应严格控制赠卵技术的实施，严格掌握接受卵子赠送的适应证；二、赠卵者仅限于接受人类辅助生殖治疗周期中取卵的妇女；三、为保障赠卵者的切身利益，应当在其每周期取成熟卵子20个以上，并保留15个以上的基础上进行赠卵；四、应当在赠卵者对所赠卵子的用途、自身权利和义务完全知情同意的基础上进行；五、对赠卵者应参照供精者筛选的程序和标准进行相关的健康检查及管理；六、对实施赠卵技术而获得的胚胎必须进行冷冻，对赠卵者应在半年后进行艾滋病抗体和其他相关疾病的检查，获得确定安全的结果后方可解冻相关胚胎；七、对接受赠卵的患者要依据病情和就诊时间进行排队；八、严禁任何形式的商业化赠卵和供卵行为。”

根据卫生部的规定，赠卵者为正在进行辅助生育治疗的患者。受卵者根据卵巢是否有功能而决定冷冻胚胎移植方案，卵巢无功能者需行几个月的激素替代治疗，有卵巢功能者可以使用自然周期冷冻胚胎移植方案或激素替代周期的胚胎移植方案。

（5）赠胚和代孕：对于双方配子发生能力均有严重障碍的夫妇，接受捐赠胚胎治疗是一个有效的选择。而对于无子宫但有卵巢、因癌症行子宫切除、反复流产的妇女，代孕是一个可行的选择。但是目前在我国大陆，由于涉及复杂的伦理社会问题，尚不允许开展赠胚和代孕。

23．2．12 辅助生育技术对妇女健康/子代健康的影响

23．2．12．1 辅助生育技术对妇女健康的影响

激素是妇科肿瘤的病因之一，因此生殖医学中使用的促排卵药物对这些肿瘤发生的风险是否有影响进行了相关的研究。很多研究由于缺乏对照或者随访时间短，而未获得定论。卵巢癌是危害妇女健康的癌症之一，其中90％的卵巢癌来源于上皮细胞。一些因素影响卵巢癌的发生，如基因、环境和内分泌等。自20世纪80年代以来，在各大洲报道了不孕症治疗后几十例恶性或交界性肿瘤患者。在病例－对照研究中，发现只有一种促排卵药物与卵巢癌有关，这是一个综合分析了美国的12个病例－对照研究，比较了2 197例卵巢癌患者和8 893例对照。另外，使用促排卵药物还增加了卵巢上皮交界性细胞瘤的发生。但是，也有很多其他研究没有发现促排卵治疗与卵巢癌有关联。有研究发现使用氯米芬≥12个周期可以增加卵巢癌的风险，无论有无生育史。其他大部分研究并没有发现其中存在关联，包括大样本量研究。同未接受IVF治疗的不孕症妇女相比，其他妇科肿瘤如乳腺癌、子宫内膜癌在接受IVF治疗的妇女中发病率并无升高，资料显示不孕妇女的子宫内膜癌发生率比正常人群有所升高。

综合上述，建议临床上在促排卵治疗前排除已经存在的卵巢癌，告知患者可能存在的风险，尤其是高发人群，以及避免长期使用促排卵治疗，如氯米芬。另外，病例－对照研究和队列研究各有优缺点，尚需要更进一步的大样本量和长期随访的队列研究来得出明确结论。

23．2．12．2 辅助生育技术对子代健康的影响

辅助生育对子代的健康影响一直以来都受到关注，特别是由于男性因素而行卵胞浆内单精子注射（ICSI）后生育的男孩健康更为引起关注，这是由于男性不育可由基因导致，包括Y基因微缺失、X染色体和长染色体异常等，或者由于基因缺陷而导致精子超微结构异常。理论上ICSI的男性后代可能异常的发生率升高，但目前的数据还不能获得最后结论。

国内外研究表明，辅助生育技术出生的婴儿先天畸形发生率与一般自然受孕人群无显著差别。虽然来自辅助生育技术儿童的早产率和低出生体重发生率高，但可能与多胎妊娠发生率高有关。来自不同辅助生殖方式包括IVF、ICSI和FET出生单胎儿童与自然受孕出生儿童体格和精神运动发育亦无差异。目前得出的结论是辅助生育技术对子代的健康无不利影响，但需控制多胎的发生率，减少多胎造成对子代健康的影响。

23．2．13 辅助生育对人员、场地和设备的要求

根据卫生部2003年《人类辅助生殖技术规范》，对从事辅助生殖的人员、场地和设备有以下要求。

（1）在编人员要求：机构设总负责人、临床负责人和实验室负责人，临床负责人与实验室负责人不得由同一人担任。

生殖医学机构的在编专职技术人员不得少于12人，其中临床医师不得少于6人（包括男科执业医师1人），实验室专业技术人员不得少于3人，护理人员不得少于3人。上述人员须接受卫生部指定医疗机构进行生殖医学专业技术培训。

外籍、中国台湾地区、香港和澳门特别行政区技术人员来内地从事人类辅助生殖诊疗活动须按国家有关管理规定执行。

1）临床医师：①专职临床医师必须是具备医学学士学位，并已获得中级以上技术职称或具备生殖医学硕士学位的妇产科或泌尿男科专业的执业医师。②临床负责人必须由从事生殖专业具有高级技术职称的妇产科执业医师担任。③临床医师必须具备以下方面的知识和工作能力：掌握女性生殖内分泌学临床专业知识，特别是促排卵药物的使用和月经周期的激素调控；掌握妇科超声技术，并具备卵泡超声监测及B超介导下阴道穿刺取卵的技术能力，具备剖腹手术的能力；具备处理人类辅助生殖技术各种并发症的能力。④机构中应配备专职男科临床医师，掌握男性生殖医学基础理论和临床专业技术。

2）实验室技术人员：①胚胎培养实验室技术人员必须具备医学或生物学专业学士以上学位或大专毕业，并具备中级技术职称；②实验室负责人必须由医学或生物学专业高级技术职称人员担任，具备细胞生物学、胚胎学、遗传学等相关学科的理论及细胞培养技能，掌握人类辅助生殖技术的实验室技能，具有实验室管理能力；③至少一人具有按照WHO精液分析标准程序处理精液的技能；④至少一人在卫生部指定的机构接受过精子、胚胎冷冻及复苏技术培训，并系统掌握精子、胚胎冷冻及复苏技能；⑤开展ICSI的机构，至少有一人在卫生部指定机构接受过本技术的培训，并具备熟练的显微操作及体外受精与胚胎移植实验室技能；⑥开展植入前胚胎遗传学诊断的机构，必须有专门人员接受过极体或胚胎卵裂球活检技术培训，熟练掌握该项技术的操作技能，掌握医学遗传学理论知识和单细胞遗传学诊断技术；所在机构必须具备遗传咨询和产前诊断技术条件。

3）护士：必须有护士执业证书，受过生殖医学护理工作的培训，护理工作的负责人必须具备中级技术职称。

（2）场所要求

1）场所须包括候诊区、诊疗室、检查室、取精室、精液处理室、资料档案室、清洗室、缓冲区（包括更衣室）、超声室、胚胎培养室、取卵室、体外受精实验室、胚胎移植室及其他辅助场所。

2）用于生殖医学医疗活动的总使用面积≥260m2。

3）场所布局须合理，符合洁净要求，建筑和装修材料要求无毒，避开对工作产生不良影响的化学源和放射源。

4）工作场所须符合医院建筑安全要求和消防要求，保障水、电供应。各工作间应具备空气消毒设施。

5）主要场所要求：①超声室使用面积≥15m2，环境符合卫生部医疗场所Ⅲ类标准。②取精室与精液处理室邻近，使用面积≥5m2，配有洗手设备。③精液处理室使用面积≥10m2。④取卵室，供B超介导下经阴道取卵用，使用面积≥25m2，环境符合卫生部医疗场所Ⅱ类标准。⑤体外受精实验室使用面积≥30m2，并具备缓冲区。环境符合卫生部医疗场所Ⅰ类标准，建议设置空气净化层流室。胚胎操作区必须达到百级标准。⑥胚胎移植室使用面积≥15m2，环境符合卫生部医疗场所Ⅱ类标准。

（3）设备条件：主要包括以下设施：2台B超：（配置阴道探头和穿刺引导装置）、负压吸引器、妇科床、3台超净工作台、解剖显微镜、生物显微镜、倒置显微镜（含恒温平台）、精液分析设备、CO2培养箱（至少3台）、CO2浓度测定仪、恒温平台和恒温试管架、冰箱、离心机、实验室常规仪器（如p H计、渗透压计、天平、电热干燥箱等），以及配子和胚胎冷冻设备包括冷冻仪、液氮储存罐和液氮运输罐等。

申报开展ICSI的机构，必备具备显微操作仪1台。

（陈军玲）

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